循环血外泌体miR-320对NSTEMI的鉴别诊断价值研究

杨 濛，丁 辉

急性冠脉综合征是目前我国居民死亡和影响伤残调整生命年的首位原因，且随着人口老龄化其对伤残调整生命年的影响还在逐年上升[1]。急性冠脉综合征的诊断主要从症状、心电图及心肌损伤标志物三方面考虑，而非ST段抬高心肌梗死（NSTEMI）由于没有典型心电图表现诊断更为困难[2]，目前高敏心肌肌钙蛋白（hs-cTnI）为NSTEMI唯一推荐的血清学诊断标志物，但由于其与心肌损伤相关，除心肌梗死外，在心肌炎、心包炎、肺栓塞等多种疾病中也可升高，诊断特异度欠佳，仍有待开发针对NSTEMI的特异性标志物[3]。外泌体是直径30～150 nm的细胞外囊泡，由于其中可装载各种细胞内组分如蛋白质、RNA、脂质已成为多种疾病的候选诊断标志物[4-6]，通过对NSTEMI患者外周血外泌体的筛选笔者发现微小RNA miR-320的表达上调，本研究将进一步探讨循环血外泌体miR-320对NSTEMI的鉴别诊断价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 连续纳入2017年1月～2019年7月医院收治的NSTEMI患者112例作为观察组训练集，同期纳入非心肌梗死患者37例作为对照组，其中病毒性心肌炎12例，急性肺栓塞25例；纳入2019年8月～2020年12月医院收治的NSTEMI患者75例作为观察组测试集，同期纳入非心肌梗死患者21例作为对照组，其中病毒性心肌炎9例，急性肺栓塞12例。所有患者入院后收集年龄、性别、BMI、血脂情况、高血压及糖尿病史、肝肾功能、凝血功能及心肌损伤标志物水平。

1.2 纳入与排除标准 观察组纳入标准：（1）有典型症状及心电图改变或有缺血性胸痛病史；（2）年龄≥18岁；（3）发病时间12～24 h；（4）冠状动脉造影显示心电图缺血导联对应的冠脉管腔狭窄≥50%，符合上述全部选项者纳入本研究。对照组纳入标准：（1）出现典型症状及心电图改变；（2）年龄≥18岁；（3）发病时间12～24 h；（4）3 w内有病毒感染症状，如乏力、发热、头痛等；（5）CT肺动脉造影确诊为急性肺栓塞。排除标准：（1）冠状动脉痉挛、心肌桥、冠状动脉畸形以及继发因素导致的急性心肌梗死患者；（2）合并甲亢、贫血等代谢性疾病；（4）妊娠期妇女；（5）合并急慢性感染；（6）心源性休克；（7）合并严重肝肾功能不全；（8）临床数据不完整，依从性差。符合上述任1选项者不纳入本研究。本研究已上报医院伦理委员会批准。

1.3 外周血外泌体提取与鉴定 患者入院时抽取5 ml外周静脉血，在4℃下500 r/min离心15 min后收集血清，使用exoRNeasy Serum/Plasma Midi试剂盒（中国上海，Qiagen公司，货号77044）和超速离心（中国上海，Beckman公司，Optima TM L-80 XP）120 000 r/min离心80 min提取外泌体，剩余血浆用PBS（1∶1）稀释用作对照，通过ZetaviewTM纳米生物颗粒分析仪对外泌体的布朗运动进行追踪和分析，结合Stockers-Eiustein方程计算外泌体的流体力学直径和浓度。

1.4 总RNA提取及逆转录 将RNeasy MinElute离心柱放入1.5 ml收集管中，在离心柱膜中央加入14μl无核酶水，静置1 min，然后25℃下5000 r/min离心1 min洗脱总RNA，超微量分光光度计（中国上海，赛默飞世尔科技有限公司，货号NanoDrop2000）测定总RNA浓度及纯度。取RNA 0.5μg使用SuperScriptTMⅢ逆转录试剂盒(中国上海,赛默飞公司,货号18080044)合成miRNA的互补DNA。逆转录反应条件：16℃30 min，42℃30 min，85℃5 min，茎环引物序列：5'-GTC GTA TCC AGT GCA GGG TCC GAG GTA TTC GCA CTG GAT ACG ACA GTG AA-3'。

1.5 实时荧光定量PCR 使用TransStartRTop Green qPCR SuperMix试剂盒(中国北京，全式金生物技术有限公司,货号AQ132-21)对miR-320进行实时荧光定量PCR，PCR反应在LightCycler480Ⅱ实时荧光定量PCR系统(中国上海，罗氏公司)上进行，以U6作为内参，正向引物：5'-GCA CTT TAT TGG TCC ATC ATC C-3'； 反 向 引 物 ：5'-GAC ACC TGG CTC TTT TTG ATT C-3'。PCR反应条件：95℃预变性3 min，95℃变性15 s，58℃退火30s，72℃延伸30 s，40个循环后通过Ct值，即荧光强度达到给定阈值时所需的循环数并计算2-△△CT来定量microRNA的表达，miR-320正向引物：5'-ACA CTC C AG CTG GGA AAA GCT GGG TTG AGA-3'；反向引物：5'-TGG TGT CGT GGA GTCG-3'。

1.6 统计学方法 应用SPSS 19.0软件进行统计学处理。计量资料以均数±标准差表示，比较采用t检验；计数资料以例和百分率表示，比较采用χ2检验；使用皮尔逊线性相关分析两计量资料间的相关性；使用受试者工作特征曲线（ROC）及其曲线下面积（area under the curve,AUC）评估诊断效能，ROC之间比较采用Z检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 研究对象基线资料 观察组BMI、血脂异常比例、hs-cTnI、肌酸激酶、肌酸激酶同工酶及血清miR-320相对表达量均高于对照组，D二聚体水平低于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)，见表1。

2.2 miR-320与hs-TnI水平的相关性 观察组miR-320表达量与hs-TnI水平相关系数为0.831(95%可信区间0.782～0.871，P＜0.001）， 对照组miR-320表达量与hs-TnI水平相关系数为0.383(95%可信区间0.138～0.583，P＜0.01），见图1。

2.3 训练集中miR-320及hs-cTnI的诊断效能miR-320诊断NSTEMI的AUC值为0.899(95%可信区间0.839～0.943），高于hs-cTnI的0.739(95%可信区间0.661～0.808)，差异有统计学意义（Z=3.100，P＜0.01），见图2。根据ROC曲线确定的miR-320和hs-cTnI最佳灵敏度和特异度下截断值分别为1.14和0.18 ng/ml。miR-320诊断NSTEMI的灵敏度、特异度、阳性似然比、阴性似然比及正确指数分别为79.4%、91.9%、9.80、0.22、0.64；hs-cTnI诊断NSTEMI的灵敏度、特异度、阳性似然比、阴性似然比及正确指数分别为73.2%、70.3%、2.46、0.38、0.43。

2.4 miR-320及hs-cTnI的诊断效能测试miR-320诊断NSTEMI的AUC值为0.876(95%可信区间0.792～0.934），高于hs-cTnI的0.778(95%可信区间0.681～0.856)，差异有统计学意义（Z=2.639，P=0.032），见图3。使用训练集miR-320最佳截断值miR-320诊断NSTEMI的灵敏度、特异度、阳性似然比、阴性似然比及正确指数分别为73.3%、90.5%、7.70、0.29、0.64；hs-cTnI诊断NSTEMI的灵敏度、特异度、阳性似然比、阴性似然比及正确指数分别为42.7%、95.2%、8.96、0.60、0.38。

表1 研究对象基线资料比较

图1 miR-320与hs-TnI水平的相关性

图2 miR-320及hs-TnI诊断NSTEMI的ROC曲线

图3 测试集ROC曲线

3 讨论

hs-TnI诊断NSTEMI的内部真实性已得到了充分的验证，其区分NSTEMI与不稳定心绞痛的特异度和敏感度均达90%以上[7]，然而，对于其外部真实性如与心肌损伤相关疾病的鉴别诊断效能仍未得到充分证实，目前已有文献报道hs-TnI也会受到其他心脏疾病如心肌炎、心包炎、主动脉夹层，免疫性疾病如系统性红斑狼疮以及尿毒症、脓毒症等诸多疾病的干扰[8]，其中病毒性心肌炎及肺栓塞由于与NSTEMI症状相似极易误诊，因此人们重点关注病毒性心肌炎及肺栓塞与NSTEMI的鉴别诊断。

从基线资料来看，观察组BMI、血脂异常比例均高于对照组，这在于两者均为NSTEMI发病的重要危险因素，而hs-cTnI、肌酸激酶、肌酸激酶同工酶作为心肌损伤标志物同样在NSTEMI组中升高，D二聚体水平作为提示肺栓塞的重要标志物，其在对照组中升高与临床经验相符。更重要的是，观察组miR-320相对表达量高于对照组，这与本研究预试验的结果一致，先前Zhang等[9]的研究指出miR-320在缺氧缺糖/复氧复糖心肌细胞模型中发挥诱导损伤的作用，Li等[10]的研究则发现miR-320可加剧高血糖引起的心脏功能障碍，类似Yang等[11]的研究指出miR-320可拮抗胰岛素介导的心脏保护作用，这些结果均提示miR-320在缺血性心脏病中的上调是其病理生理过程中重要的环节，此外，根据这些研究的结果miR-320对心肌损伤的介导作涉及多种转录因子、非编码RNA及PI3K/Akt/mTOR信号通路等与hs-TnI不同的分子及信号转导过程，这可能是其表现出相比hs-TnI更具鉴别诊断价值的细胞生物学基础。

尽管miR-320在心肌损伤中的作用已有少量文献报道，但其在临床样本尤其是外周血外泌体中的表达尚未见研究报道，事实上外泌体发挥着载体及膜屏障的作用从而富集并且保护微小RNA免受免疫系统攻击，因此从其已成为检测外周血微小RNA表达的重要媒介[12]。目前已报道有数种外泌体微小RNA如miR-21、miR-183、miR-204有潜在的心肌梗死诊断及病情监测价值[13-15]，本研究结果显示miR-320在NSTEMI与病毒性心肌炎和肺栓塞的鉴别诊断中有着高于hs-cTnI的诊断效能，在训练集和测试集中hs-cTnI诊断特异度存在较大波动，说明其在此类鉴别诊断患者中易受到患者个体差异的影响，易出现假阳性，而miR-320与其相比效能更为稳定且有效弥补了其诊断特异度上的不足，有助于排除假阳性患者，而从相关性分析结果来看两者在观察组患者中具有较好相关性但在对照组中相关性欠佳，这可能在于病毒性心肌炎和肺栓塞与心肌梗死在病理生理机制上的差异，病毒性心肌炎心肌损伤的机制主要来自于机体对病毒的异常免疫应答，而肺栓塞导致hs-cTnI升高的原因可能在于继发于肺动脉阻力增加的急性右心室应激及通气-灌流失衡，未来对miR-320介导心肌损伤机制研究的进展将有助于揭示这些结果的内在原因。

本研究主要不足指之处在于受本中心临床病例的限制，尽管设计了训练集及测试集探讨miR-320的诊断价值，但未能安排验证集，后续研究有必要纳入其他中心病例作为外部验证，此外，各指南及文献均指出hs-TnI在肾功能不全患者中诊断效能受到极大限制[16]，而miR-320是否能改善这一缺陷有待后续研究进一步探讨，最后，临床中偶可出现肺栓塞与心肌梗死并发的病例如Leriche综合征，极易造成漏诊[17]，由于受到样本量限制对此类患者的诊断有赖于进一步研究跟进。

综上所述，循环血外泌体miR-320能有效区分NSTEMI与病毒性心肌炎和急性肺栓塞患者，对NSTEMI的鉴别诊断有较好应用前景。