BRCA1表达与Ⅲ期胃腺癌患者术后特异性生存的关系*

姬玉，王建，吴昊，方乐平，黄普文

210000 南京，南京医科大学第一附属医院 肿瘤科

胃癌是全球第5最常见的恶性肿瘤和癌症死亡的第3大原因，患者多分布在东亚[1]。胃癌的发生、进展是多因素、多步骤、多阶段共同作用结果，癌细胞浸润、转移是造成胃癌患者死亡的主要原因，但确切分子作用机制目前尚未完全阐明[2]。根据NCCN指南，目前胃癌的治疗方式主要包括手术、化疗、放疗、分子靶向药物治疗；针对晚期或转移性胃癌，免疫治疗正处于临床研究中。就当前医学的发展情况来看，根治性手术是无远处转移胃癌患者最有效的治疗方法。然而由于早期胃癌病情隐匿性强，不利于早期诊断，很多胃癌患者确诊时就已处于进展期，单纯进行手术治疗效果不佳。现阶段，对于根治术后的胃癌患者主张采取个体化综合治疗，其中辅助化疗的地位日益提高[3-4]。近年来，由于胃癌的早期筛查及外科手术的规范化，诊断早期胃癌的阳性率提高，胃癌的病死率下降，但5年生存率仍不足20%[5]。分期相同的患者，其预后也不同。基于此，临床医学有必要深入探索胃癌预后因素，以提高疾病的治疗效果。

作为一个抑癌基因，BRCA1有DNA损伤修复功能，这是通过多条信号转导途径从而激活DNA损伤修复的调控点来实现的。BRCA1在对危险的DNA损伤(包括DNA双链断裂)的反应中起着重要作用，这些损伤可以通过无错误的同源重组进行修复[6]。此外，BRCA1与许多参与染色质重构、转录调控和细胞周期的蛋白质相互作用，以维持基因组的完整性[7]。BRCA1的改变会导致DNA复制错误和突变，从而导致肿瘤生长。铂类化疗药物通过形成DNA加合物和诱导DNA损伤发挥细胞毒性作用，是治疗胃癌的常用有效药物。如果DNA损伤没有及时得到修复，则会导致细胞凋亡。BRCA1突变所致的蛋白功能缺失或者是BRCA1蛋白的低表达将减弱机体DNA的损伤修复功能，这时肿瘤对于铂类药物的敏感性可能提高，化疗效果更佳[8]。因此，本研究尝试探索胃腺癌中BRCA1蛋白表达情况与胃癌患者生存的相关性，以期为临床工作提供指导。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选择2007年1月至2009年12月于南京医科大学第一附属医院行胃癌D2根治术并经病理确诊的Ⅲ期胃癌患者共300例，获取其手术切除的胃癌组织石蜡包埋标本。其中男218例，女82例，年龄24～93岁。300例患者中共有223例接受了术后辅助化疗，77例因患者意愿未行辅助化疗。纳入标准：1)患者的术后病理资料、病历资料详细完整；2)所有的组织学类型都是腺癌；3)采取胃切除术联合D2淋巴结清扫术进行治疗；4)术后辅助化疗患者采用顺铂/奥沙利铂联合氟尿嘧啶类两药方案，且至少完成4个周期的辅助化疗。排除标准：1)死亡的原因与胃癌无关；2)存在严重器质性疾病；3)术前行新辅助化疗；4)手术前或手术后行放射治疗。

1.2 随访及生存时间计算

随访方式：主要通过电话随访进行，必要时查询患者住院日志等信息获取患者随访资料；术后2年内定期复查(每3个月一次)，术后5年内每半年检查一次，术后5年后每年检查一次。随访内容：询问病史以及相关辅助检查结果，比如胸腹部CT、胃镜、肿瘤标志物等。随访截止日期：2020年7月31日。本次研究中以获得病理确诊为起始事件，以患者死于癌症或癌症相关并发症为结局事件，截尾数据为随访结束时仍然存活的患者数据。生存时间计算为确诊之日至死亡或末次随访日。

1.3 免疫组织化学染色

采用EnVision二步法检测BRCA1蛋白的表达情况，具体步骤为：首先将石蜡标本切成4 μm切片，并将标本放置在温度为65℃的烤箱之中，两个小时后取出；其次，采用常规二甲苯脱蜡，水化梯度酒精水化；第三步是阻断内源性过氧化物酶，将标片放于室温3%过氧化氢室，孵育10分钟；第四步是修复高压抗原热，煮沸其中的修复液后放入组织玻片并使之完全浸泡于其中，观察排气阀是否排气，待其排气后等待3分钟使之自然冷却；第五步滴加一抗(鼠抗人Ig)，并放于温度为4℃的冰箱中过夜；第六步用PBS缓冲液冲洗并加入二抗(羊抗鼠Ig)，让其在室温下孵育30分钟；第七步是DAB显色液显色，控制其显示时间，利用显微镜掌握其染色程度；最后使用自来水充分冲洗，复染苏木精，梯度酒精脱水、二甲苯透明、封片。严格按照说明书要求执行各个步骤，以同一条件下已知阳性切片染色为阳性对照，PBS缓冲液代替一抗作阴性对照。

1.4 结果判定

本院病理科医师采用单盲法阅片，基于随机选择5个视野，一个视野可记细胞数为200，评分依据是染色细胞占比及细胞染色程度。从染色程度上看，着深褐色、棕黄色、淡黄色、基本不着色对应的分值分别为3、2、1、0。染色细胞所占百分数：1.0表示染色细胞≥50%；0.5表示染色细胞在10%～49%；0.1表示染色细胞在1%～9%；如无细胞着色则用0表示。计算出染色细胞百分比评分、染色深度的乘积，如果得出的值≥1.0，则说明为阳性表达；反之则为阴性表达。

1.5 统计学方法

采用SPSS 25.0软件进行统计学分析。计数资料的比较采用χ2检验，生存分析采用Kaplan-Meier法，其中生存曲线的比较采用Log-rank检验，最后采用Cox比例风险回归模型进行多因素分析确立胃癌的独立预后因素。所有的检验均为双侧检验，检验水准α=0.05。

2 结 果

2.1 BRCA1蛋白在胃癌组织中的表达

在正常胃黏膜中BRCA1蛋白主要定位于细胞核(图1A)，表明核表达是BRCA1的正常生理表型。但是在胃癌组织中，BRCA1蛋白几乎都表达于细胞浆，染色强度从不着色到明显着色(图1B～E)。其中BRCA1表达阳性97例，阴性203例，阳性率为32.3%。

图1 BRCA1蛋白在正常胃黏膜和胃癌组织中的表达(×200)

2.2 III期胃腺癌术后患者的生存状况

300例III期胃腺癌术后患者随访截止时共有47例患者生存，253例患者死亡。BRCA1阳性患者的总生存概率高于阴性患者(18.56%vs14.29%)(表1)。

表1 III期胃腺癌患者的生存状况

2.3 BRCA1表达与临床病理特征的关系

不同组织学分级的患者BRCA1表达存在差异，差异有统计学意义(P<0.001)，而不同性别、年龄、肿块大小、浸润深度、脉管神经受侵情况、淋巴结转移、分期的患者BRCA1表达差异均无统计学意义(P>0.05)(表2)。

2.4 BRCA1表达与胃癌患者生存的关系

2.4.1 BRCA1表达状况对III期胃腺癌患者特异性生存的影响 300例III期胃癌BRCA1阴性203例，中位生存时间(median survival time,MST)23.50个月，5年生存率19.2%；阳性组97例，MST为27.50个月，5年生存率21.6%，差异无统计学意义(P=0.209)(图2A)。

2.4.2 未接受含铂辅助化疗胃腺癌患者BRCA1表达对特异性生存的影响 77例患者未接受辅助化疗，其中BRCA1表达阳性患者28例，MST为18.57个月，5年生存率17.9%；表达阴性患者49例，MST为17.90个月，5年生存率6.1%，差异无统计学意义(P=0.122)(图2B)。

2.4.3 接受含铂辅助化疗胃腺癌患者BRCA1表达对特异性生存的影响 223例患者接受辅助化疗，其中BRCA1表达阳性患者69例，MST为28.67个月，5年生存率23.2%；表达阴性患者154例，MST为24.30个月，5年生存率23.4%，差异无统计学意义(P=0.493)(图2C)。

表2 BRCA1的表达与临床病理特征的关系

2.4.4 含铂辅助化疗对总体胃腺癌患者特异性生存的影响 223例患者接受辅助化疗，77例患者未接受辅助化疗，化疗组MST为26.17个月，5年生存率23.3%；未化疗组MST为18.57个月，5年生存率10.4%，差异有统计学意义(P=0.016)(图3A)。

2.4.5 含铂辅助化疗对BRCA1表达阴性胃腺癌患者特异性生存的影响 BRCA1表达阴性的III期患者共203例，其中154例患者行术后辅助化疗，49例患者无辅助治疗。化疗组MST为24.30个月，5年生存率23.4%；未化疗组MST为18.57个月，5年生存率6.1%，差异有统计学意义(P=0.006)(图3B)。

2.4.6 含铂辅助化疗对BRCA1表达阳性胃腺癌患者特异性生存的影响 BRCA1表达阳性的III期患者共97例，其中69例患者行术后辅助化疗，28例患者无辅助治疗。化疗组MST为28.67个月，5年生存率23.2%；未化疗组MST为17.90个月，5年生存率17.9%，差异无统计学意义(P=0.526)(图3C)。

2.5 Cox多因素分析

采用Cox比例风险回归模型对300 例Ⅲ期胃癌术后病例进行多因素分析，将性别、年龄、肿瘤大小、分化程度、浸润深度、脉管神经侵犯、淋巴结转移、有无化疗、BRCA1表达纳入分析的变量。结果显示，胃癌的独立预后因素包括肿块大小、淋巴结转移和化疗与否(表3)。

图2 BRCA1表达状况与胃腺癌患者特异性生存的关系

图3 含铂辅助化疗对胃腺癌患者特异性生存的影响

表3 胃癌患者预后的多因素分析

3 讨 论

BRCA1是第一个被发现的乳腺癌易感基因，1994年由Miki等采用定位克隆方法分离出来[9]。BRCA1定位于染色体17q12-21，包含22个编码外显子和2个非编码外显子，共24个外显子，全长l00 kb，转录产物mRNA为7.8 kb，编码含1 863个氨基酸残基的蛋白质[10]。BRCA1蛋白分子量为220 kb，在正常的乳腺上皮细胞和卵巢生发上皮的细胞核中表达。当前已经明确细胞DNA损伤可通过如下4种机制进行修复：其一是核苷酸切除修复(nucleotide excision repair,NER)；其二是双链断裂修复(double-strand break repair,DSBR)；其三是同源重组修复(homologous recombination repair,HRR)；其四是错配修复(mismatch repair,MMR)。BRCA1在DSBR中起重要作用：1)可通过与DNA损伤修复功能必需的结构单元RAP80受体相关蛋白80(RAP80)作用，将BRCA1定位到DNA断裂部位，参与DNA损伤的修复，且能特异性作用于细胞周期G2/M检控点[11]；2)能通过泛素连接酶在DNA损伤修复中发挥作用；3)当DNA受损时，可与受伤部位发生磷酸化组蛋白作用，通过HRR途径与非同源末端连接途径，协调DNA的修复，且可切断损伤部位的DNA双链，产生单链DNA，并调节单链DNA长度和持续时间；4)具有DNA依赖性ATP酶和DNA解旋酶活性，是双链DNA损伤修复所必需的；5)是DNA重组和双链DNA损伤修复的关键蛋白。此外BRCA1还具有调控转录功能，并可以调节细胞凋亡[7,12]。

BRCA1为抑癌基因，当其表达缺失或发生基因突变时，可降低BRCA1蛋白合成量，对癌细胞抑制作用减弱，增加罹患癌症风险。肿瘤患者若BRCA1蛋白低表达，则其DNA损伤的修复能力减弱，基因不稳定性增加，可能导致肿瘤的生长速度加快等恶性生物学表现，进而预后不良。

基于这些理论，学者们认为BRCA1蛋白的表达与肿瘤的发生、发展及预后相关。awniczak等[13]报道显示，BRCA1突变与胃癌患病和复发有关。1998年Jarvis指出，BRCA1低表达可以导致乳腺癌细胞侵袭性增加[14]。2003年Grabsch等[15]研究了100例非家族性乳腺癌患者，发现BRCA1低表达与肿瘤低分化相关(P= 0.002)，究其原因，可能在于BRCA1蛋白表达越低，对于DNA修复作用越弱，从而导致恶性分化累计，产生细胞分化程度下降。我们的研究结果与Grabsch一致，BRCA1表达与组织学分级相关，差异有统计学意义(P<0.001)，BRCA1蛋白表达越低，细胞分化程度越差。

在消化系统肿瘤中，多项研究均证实BRCA1蛋白高表达患者预后优于低表达者[16-19]。本实验结果显示，BRCA1蛋白阳性表达患者与阴性表达患者虽然在总生存上无明显差异(P=0.209)，但是可以看到BRCA1蛋白阳性表达患者生存较阴性表达者有延长趋势，在MST上有4个月的延长(27.50个月vs23.50个月)。而在单纯手术的患者中，阳性组和阴性组MST分别为18.57个月和17.90个月，5年生存率分别为17.90%和6.10%，虽然差异无统计学意义(P=0.122)，但是可以看出BRCA1阳性组5年生存率有高于阴性组的趋势。而本研究Cox多因素分析显示BRCA1表达并非胃癌的独立预后因素。我们的结果与既往研究的结果不尽一致，可能由于我们选择的样本量相对较少，不足以反映胃癌整体的情况，因此还需要进行严谨的大样本的前瞻性临床研究，来评价BRCA1对胃癌患者预后判断的实际意义。尽管如此，我们认为BRCA1蛋白的表达状况对与胃癌预后仍有一定的参考价值。

BRCA1蛋白作为DNA修复蛋白，从理论上可以作为铂类药物耐药的预测指标。Huang等[20]发现，在非小细胞肺癌中，与BRCA1表达阳性的患者相比，BRCA1阴性表达的患者从辅助顺铂化疗中获益更多。Huang等的结论也被其他学者的研究加以证实[21]。Macklin-Mantia等[22]在胰腺癌中得出类似结论。而在卵巢癌和乳腺癌中，多个研究也均证实BRCA1蛋白可以预测铂类药物疗效[8,23-24]。

我们研究结果显示，在所有接受术后辅助化疗的患者中，BRCA1蛋白的表达情况与总生存无关(P=0.493)。在BRCA1阴性表达患者中，化疗组MST为24.30个月，5年生存率23.40%，而未化疗组MST为18.57个月，5年生存率6.10%，差异有统计学意义(P=0.006)，提示BRCA1阴性表达的Ⅲ期胃癌患者行含铂方案的术后辅助化疗可以带来生存获益，这一结果与其他学者的研究一致[16-17,25]。BRCA1阳性表达患者中，虽然化疗组生存略优于未化疗组，但差异无统计学意义(P=0.526)，提示BRCA1阳性表达者可能并不能从含铂方案的术后辅助化疗中取得生存获益。因此，作者认为BRCA1蛋白可以作为III期胃癌患者术后辅助化疗疗效的预测指标。

综上所述，BRCA1的表达对患者预后的评估及预测铂类药物疗效上有一定的临床意义。BRCA1阳性表达的患者预后较好，但同时对铂类药物相对耐药，未能从铂类药物化疗中显著获益；而BRCA1阴性表达的患者预后较差，但同时对铂类药物相对敏感，可以从铂类药物化疗中显著获益。探寻评估预后的个体化分子标志物尚有待进一步的研究，以期指导临床，从而真正达到治疗个体化，使患者得到最大受益。

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