多模式超声联合BRAF突变检测对甲状腺TI-RADS 4～5类结节的诊断价值*

苟博，邓思会，周江英，辛凤月，徐沁梅，刘健

610000 成都，成都医学院临床医学院·第一附属医院 超声科

随着影像医学的快速发展，甲状腺结节被大量检出，特别是甲状腺癌占全身恶性肿瘤的10%[1]。其中，又以甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma,PTC)最为常见，约占所有甲状腺肿瘤的75%[2]。目前国内PTC的发病率呈逐年上升趋势[3]。据报道，高达97%的高分化PTC存在基因突变[4]，主要与鼠类肉瘤滤过性毒菌致癌同源体B1(v-raf murine sacoma viral oncogene homolog B1,BRAF)基因V600E突变有关[5]。由于良恶性结节的超声声像图特征间常存在交叉、重叠[6]，本文拟探讨多模式超声，即涵盖常规超声(conventional ultrasound,CU)、超声造影(contrast-enhanced ultrasonography,CEUS)、超声引导下针吸细胞学检查(ultrasound-guided needle aspiration cytology,US-FNA)多种方法与手段的超声诊断技术，并与BRAF突变检测联合的诊断效能，寻求如何合理应用多模式超声诊断技术有效鉴别甲状腺结节的良恶性，进而指导临床治疗方式和改善患者的预后。

1 资料与方法

1.1 研究资料

纳入标准:采用Kwak[7]的甲状腺影像报告和数据系统(Thyroid Imaging Reporting and Data System,TI-RADS)分类标准，纳入于我院2017年1月至2020年1月期间CU检查提示TI-RADS 4～5类甲状腺结节，且同时行CEUS、US-FNA及穿刺样本BRAF基因突变检测的患者。通过医院伦理委员会后开展研究，且与患者签署知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1 主要仪器与试剂 LOGIC E9超声诊断仪(探头L12-5/5～13 MHz)。六氟化硫微泡造影剂(Bracco Suisse SA)、基因组提取试剂盒(DP304)/2×PCR Master Mix试剂盒、低温高速离心机(Thermo Fisher)、PCR仪(BIO-RAD)、超微量分光光度计(Thermo Fisher)等。

1.2.2 CU检查 采用Kwak[7]提出的TI-RADS分类标准。由于TI-RADS 4a类结节的恶性风险较低(3.3%)，TI-RADS 4b～5类结节的恶性风险高(>9.2%)，因此本文将TI-RADS 4a类结节倾向于良性，TI-RADS 4b～5类结节倾向于恶性。

1.2.3 CEUS检查 注射六氟化硫微泡造影剂1.4 mL后，即可进入造影模式。观察结节增强强度、增强模式、是否环状增强、增强后边界、消退模式等方面综合评估[8]。结合国内外文献，本研究对将具有均匀高增强、环状增强、增强后边界清、等进等退这些特征中2项或以上的结节归为良性，将具有不均匀低增强、无环状增强、增强后边界模糊、快/等进快退这些特征中2项或以上的结节归为恶性。

1.2.4 US-FNA检查 在超声引导下进行多点针吸细胞学检查US-FNA(22G)。涂片2片送细胞学检查；另留取细胞保存于1.5 mL离心管(1 mL液基细胞保存液，4℃保存)用于BRAF突变检测。所有CU、CEUS及US-FNA检查、病理学诊断分别由同一名高年资副主任医师完成。

1.2.5BRAFV600E突变检测BRAF突变是PTC中最常见的，而BRAF突变中以BRAFV600E突变为主[9]。首先使用基因组提取试剂盒(DP304)对穿刺样本进行DNA提取，将提出的DNA产物使用超微量分光光度计测量波长为260 nm和280 nm的光吸收值，分析其浓度和纯度。接着，BRAF基因第15外显子扩增，扩增片段长度为218 bp。完成引物序列和PCR产物的合成与测序，比较正常基因DNA序列，观察是否发生点突变。

1.2.6 多模式联合应用的诊断标准 联合任意两种模式诊断：两种方式均诊断为“良性”或“阴性”时，则该结节归为良性；当两种方式诊断不一致时，只要其一诊断为“恶性”或“阳性”，则该结节归为恶性[5]。

1.3 统计学处理

采用SPSS 23.0统计分析，使用χ2检验比较不同方式检查TI-RADS 4a类和TI-RADS 4b～5类结节的诊断结果。比较受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线和曲线下面积(area under the curve,AUC)，通过Z检验对各种诊断方式ROC曲线面积差异性分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 术后病理及随访结果

本研究共纳入患者150例，共172个结节(TI-RADS 4a类结节121个，TI-RADS 4b类结节32个，TI-RADS 5类结节19个)，年龄平均(41.2±10.7)岁。172个结节均行US-FNA细胞学检测，通过手术切除病理确诊恶性结节90个(PTC 84个)(图1)，良性结节58个；24个未手术的TI-RADS 4a类结节，首次US-FNA为良性，随访6月后，多模式超声复查且二次US-FNA仍为良性，则归为良性。

2.2 BRAF突变检测结果

在90个恶性结节中，有63个结节(术后证实均为PTC)呈BRAFV600E突变阳性，其中28个为TI-RADS 4a类，35个为TI-RADS 4b～5类。82个良性结节BRAFV600E突变均阴性。BRAF突变差异有统计学意义(P<0.001)(表1)。

2.3 CU、CEUS 、CU+CEUS对总体TI-RADS 4～5类结节的诊断结果

对比不同方式对总体TI-RADS 4～5类结节的诊断效能(表2)。结果显示：敏感性最高的为CU+CEUS联合诊断，特异性最高的是CU。曲线下面积ROC：AUCCU+CEUS

图1 多模式超声诊断甲状腺结节

表1 172个结节BRAF突变检测结果

表2 多模式超声对总体TI-RADS 4～5类结节的诊断结果

表3 各种诊断方式AUC差异性对比

2.4 分组分析多模式超声对TI-RADS 4a类结节的诊断结果

TI-RADS 4a类结节121个(43个恶性结节)，对比不同方式对TI-RADS 4a类结节的诊断效能(表4)。结果显示：US-FNA+CEUS在提高敏感性的同时，特异性相应降低；相比较敏感性、特异性及准确性均较高的是US-FNA+BRAF突变检测。曲线下面积ROC：AUCUS-FNA+BRAF

表4 多模式超声对TI-RADS 4a类结节的诊断结果

表5 各种诊断方式AUC差异性对比

2.5 分组分析多模式超声对TI-RADS 4b～5类结节的诊断结果

TI-RADS 4b～5类结节51个(47个恶性结节)，对比不同方式对TI-RADS 4b～5类结节的诊断效能(表6)。结果显示：US-FNA、US-FNA+BRAF突变检测敏感性、特异性及准确性较高，以后者显著。曲线下面积ROC：AUCUS-FNA+BRAF

表6 多模式超声对TI-RADS 4b～5类结节的诊断结果

表7 各种诊断方式AUC差异性对比

3 讨 论

甲状腺疾病属于内分泌系统常见病、多发病[10]，而甲状腺结节是在一般人群中常见的临床问题[11]，甲状腺结节是指甲状腺细胞在局部异常生长所引起的散在病变[12]。随着超声技术的快速发展，相继出现CEUS、US-FNA、基因检测等多途径/多模式诊断方式，甲状腺结节检出率显著增加[13-14]，有研究报道，在随机选择人群中甲状腺结节的检出率为19%～67%[15-16]。US作为甲状腺疾病首选的检查方式，具有不错的诊断效能，但不同疾病的超声表现存在交叉，因此需要多种检查手段，共同完成疾病的超声定性诊断。CEUS因有着其对微血管灌注情况动态显示的独特优势，在甲状腺良恶性结节的鉴别诊断中具有重要价值[14]，邓剑萍[17]报道CEUS技术在甲状腺良恶性结节鉴别方面特异性、敏感性均较强。US-FNA作为甲状腺结节定性诊断的主要方式，Kim等[18]报道FNA诊断PTC的敏感度为83%,特异度为92%，而Tee等[19]则报道，US-FNA具有60%～98%的高特异性，但敏感性可低至65～68%。因此是否需要对TI-RADS 4类及以上所有甲状腺结节进行US-FNA仍然存在争议。另外，有报道甲状腺癌发病率的上升主要是因为PTC的增加[20]。而BRAFV600E突变是PTC中最常见的，由于BRAFV600E突变导致RAS-RAF-MEK-ERK/MAPK通路持续激活，诱导细胞有丝分裂能力增强，最终使细胞异常增殖并诱导肿瘤发生[11],因此可通过检测BRAFV600E帮助鉴别诊断。由此可见，多模式超声在鉴别甲状腺TI-RADS 4～5类结节时，各有优势与不足。如何合理选择这些诊断手段，指导规范的穿刺及手术方案，是超声医生的首要任务[21-22]。

此次研究，在172个结节中BRAF突变63个，发生率36.6%，低于Zhang等[23]的报道；在84例PTC中BRAF突变63个，发生率75.0%，与顾华敏等[24]的报道一致。121个TI-RADS 4a类结节恶性风险35.5%(43/121)，51个TI-RADS 4b～5类结节恶性风险92.2%(47/51)，均高于董永玲等[25]报道。虽然TI-RADS 4类及以上结节作为US-FNA检查的适应症，但考虑到TI-RADS 4a类与TI-RADS 4b～5类结节恶性风险存在差异，为避免过度穿刺，本文对TI-RADS 4a、TI-RADS 4b～5类进行分组分析。对于TI-RADS 4a类结节的多模式超声方法中，CEUS敏感性高于US-FNA敏感性，CEUS有利于恶性结节的检出。CEUS还诊断良性结节49个，病理最终也证实为良性，如果这49个TI-RADS 4a类结节通过CEUS诊断未行US-FNA检查，则可让穿刺率下降40.5%。另外，US-FNA+CEUS在提高敏感性的同时，特异性相应降低；相比较敏感性、特异性及准确性均较高的是US-FNA+BRAF突变检测，其AUC为0.875。故对于TI-RADS 4a类结节：1)通过CEUS可筛选更适宜US-FNA的病例，避免过度穿刺；2)US-FNA后加做BRAF突变检测可明显提高PTC诊断准确性。在51个TI-RADS 4b～5类结节的鉴别诊断中，US-FNA表现出较TI-RADS 4a类中更高的敏感性，特异性基本相符，可能原因：1)病理结果准确与否关键在于标本取材与阅片[26]，取材受结节大小(<5 mm)、钙化、穿刺时出血或涂片不均匀等因素的影响，致使病理回示未见明显异型细胞，造成假阴性；2)结节恶性风险随着TI-RADS分类升高而增加，US-FNA的敏感性也随之升高。另外，US-FNA+BRAF突变检测表现着较高的敏感性和特异性，在准确性方面，US-FNA、US-FNA+BRAF突变检测较高，分别为96.1%、98.0%。AUCUS-FNA+BRAF和AUCUS-FNA分别为0.889、0.813，二者均表现较高的诊断效能。因此，对于TI-RADS 4b～5类结节，单独US-FNA与US-FNA+BRAF突变检测都有着较高的诊断价值，但相比较而言，联合BRAF突变检测在TI-RADS 4a类结节中诊断优势更明显。

综上所述，US、CEUS、US-FNA多模式超声在甲状腺疾病诊断中有着各自的优势，合理联合BRAF基因突变检测有利于PTC的检出，对避免过度穿刺，达到早诊断、早治疗有着重要意义。

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