诺维氏梭菌对小鼠移植性肝癌的抑制作用*

黄筱钧，邓昭敏，王红仁，邝玉，李婉宜，李明远

445000湖北 恩施，湖北民族大学医学部 病原生物学教研室(黄筱钧)；610041成都，西藏自治区人民政府驻成都办事处医院 医学检验科(邓昭敏)；610041成都，四川大学华西基础医学与法医学院 微生物学教研室(王红仁、邝玉、李婉宜、李明远)；610041成都，四川大学华西第二医院 医学检验科(李明远)

2018年全球960万人死于肿瘤，肝癌的死亡率位居第3位[1]。现有的治疗方法都不能显著延长肝癌患者的生存期，其5年生存率仅18%，探寻新的治疗方法迫在眉睫[2]。促进肝癌发展，影响肝癌等实体瘤治疗效果的最大因素是肿瘤局部微环境[3-4]，其中乏氧是肝癌微环境的重要特点。乏氧微环境是肝癌产生药物抗性和化疗抗性的主要原因，因此，破坏或利用乏氧微环境成为实体瘤治疗的新策略。300多年前就有肿瘤患者感染后肿瘤自然消退的病例记载，但因为无法解释其原理，用于治疗时无法接受发热等副反应，且治疗过程无法标准化，导致细菌抗肿瘤研究一直没有较大进展。随着生物技术的发展，研究人员利用基因改造的方法去除厌氧菌的毒性基因，或将厌氧菌改造为抗肿瘤药物的载体，从而克服厌氧菌自身的毒副作用和化疗药物选择性差、瘤内浓度低的不足，有效利用肿瘤氧含量低、血供差的微环境[5]。厌氧菌抗肿瘤随之引起了人们极大关注。

多项研究发现厌氧性细菌对实体瘤的乏氧区和坏死区具有选择性定植的能力，表现出溶瘤效应。诺维氏梭菌(Clostridiumnovyi，C.novyi)为厌氧芽胞梭菌属的成员，广泛分布于外界环境中，可从土壤、海洋沉淀物、人类气性坏疽伤口或动物的局部感染伤口中分离得到，热休克法可以获得无毒诺维氏梭菌(nontoxigenicClostridiumnovyi，C.novyi-NT)[6]。裸鼠研究结果显示，C.novyi-NT对黑色素瘤、结肠癌、肾癌、软组织肉瘤、胰腺癌、脑瘤及恶性胶质瘤均表现出抑制作用，I期临床试验证实C.novyi-NT对人体肿瘤也有抑制作用[7-11]。目前尚没有单用C.novyi-NT抗免疫正常小鼠肝癌的报道。本研究选择最常用、易操作、易观察的方法建立BALB/c小鼠H22皮下移植瘤模型，采用瘤内注射C.novyi-NT方式进行干预，评估C.novyi-NT对小鼠移植性肝癌的抑瘤效应，及其在肿瘤和重要器官的定植情况，确定瘤内注射的最佳剂量，并观察细菌干预后荷瘤鼠炎症反应、抗肿瘤免疫及肿瘤转移情况，为后续探索C.novyi-NT抗肝癌的机制奠定基础。

1 材料和方法

1.1 动物、细菌和细胞

SPF级BALB/c小鼠，雄性，体重(18±2)g，购自成都达硕实验动物有限公司(许可证号：SCXK(川) 2013-24)。实验动物所有操作取得了四川大学华西基础医学与法医学院实验动物伦理委员会批准(批号IACUC-20140010)。C.novyi为ATCC 19402株，热休克法去毒[6]，获得C.novyi-NT。肝癌H22细胞株由四川大学华西基础医学与法医学院药理学教研室保存。

1.2 主要试剂

哥伦比亚血琼脂培养基(OXOID)、细菌基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN，DP302)、组织基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN，DP304)、改良型RPMI-1640培养基(Hycone，NAD1385)，胎牛血清(Gibco，1551835)、2000bp DNA Marker(Takara，DL2000),2×Taq Master Mix(Novoprotein，E005)。

1.3 主要仪器

光学显微镜(Leica，DM750)、紫外分光光度计(K.O，K5600)、PCR仪(BIOER)、电泳仪(BIO-RAD)、凝胶成像系统(BIO-RAD)、厌氧罐(重庆艾奇医疗器械有限公司)。

1.4 主要方法

1.4.1 建立小鼠皮下移植瘤模型 收集BALB /c小鼠H22腹水，用生理盐水洗涤、离心，收集沉淀细胞，稀释为1.0×107/mL。无菌环境下，每只小鼠左前肢皮下注射0.2 mL H22细胞悬液。待肿瘤肉眼可见后每周2次用电子数显卡尺测量肿瘤大小，计算肿瘤体积。V=a×b2×1/2(V为肿瘤体积，a为肿瘤的最长径，b为肿瘤的最短径)

1.4.2 实验分组及干预 按照肿瘤建模要求(肿瘤平均重量≥1 g或20%肿瘤重量≥400 mg)衡量，32只BALB/c小鼠均造模成功。于第10天称量小鼠重量，测量肿瘤大小，随机分为对照组、C.novyi-NT低剂量组、中剂量组和高剂量组，每组8只。对照组瘤内注射0.5 mL生理盐水、低剂量组瘤内注射0.5 mLC.novyi-NT(1.0×107/mL)、中剂量组瘤内注射0.5 mLC.novyi-NT(1.0×108/mL)、高剂量组瘤内注射0.5 mLC.novyi-NT(1.0×109/mL)。每天观察小鼠的一般情况，每周3次定时称小鼠重量，每周2次测肿瘤大小，绘制小鼠重量变化、肿瘤体积变化曲线，比较组间差异。

1.4.3 采集标本 实验干预后第12天处死全部小鼠，剥离肿瘤、肝、肺、脾、脑、肾、脾脏、胸腺，肿瘤拍照记录，称肿瘤重量、脾脏和胸腺质量，用于HE染色的组织置4%多聚甲醛固定，其余组织置-80 ℃保存。计算抑瘤率、脾脏指数、胸腺指数。抑瘤率=(细菌干预组瘤重-生理盐水组瘤重)/细菌干预组瘤重×100%；脾脏(胸腺)指数(mg/10g)=脾脏(胸腺)质量mg/(小鼠重量g×10)。

1.4.4 细菌培养及鉴定 取剥离的一部分肿瘤、肝、脾、肺、肾、脑组织直接涂片后行革兰染色，一部分涂布接种于哥伦比亚血琼脂培养基，37 ℃厌氧培养72 h，观察细菌情况。按照试剂盒说明书操作步骤提取组织DNA，根据GenBank中查得的C.novyi-NT序列(Gene ID: CP000382.1) ，由成都擎科梓熙生物技术有限公司合成引物(上游引物：5′-TGCCCCTTATGTCTAGGGCT -3′,下游引物：5′-CGACTTCACCCCAATCACCA -3′)，PCR扩增产物长度为292 bp。用提取的C.novyiDNA作为模板进行PCR扩增，预变性 95℃ 5 min，变性 95℃ 30 s，退火56℃ 30 s，延伸 72℃ 20 s，30个循环，琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。

1.4.5 肿瘤和主要脏器组织HE染色 将固定24 h的组织取出，梯度脱水，常规石蜡包埋，切片后行HE染色，光学显微镜下观察肿瘤细胞、组织坏死及炎症反应情况。

1.5 统计学处理

2 结 果

2.1 荷瘤鼠干预后一般情况、体重变化

干预第2天高剂量组小鼠肿瘤部位均可观察到小红点，其他组无明显变化，随后实验组小鼠肿瘤部位出现红肿、坏死。小鼠活动量减少，精神一般，饮食、饮水量减少。随着时间延长，局部炎症反应减轻，部分肿瘤缩小。小鼠重量变化为:生理盐水组小鼠的重量持续增加；低剂量组小鼠重量前3天变化不大，随后持续增加；中剂量组小鼠重量前8天呈增加趋势，且第3～8天变化较大，第8～12天变化不明显；高剂量组小鼠重量前3天呈下降趋势，随后开始快速增加。小鼠干预前和处死后体重情况见表1，高剂量组小鼠体重与生理盐水组、中剂量组的差异均有统计学意义(P=0.033，P=0.001)；低剂量组小鼠体重与中剂量组比较，差异也有统计学意义(P=0.049)。小鼠体重结果分析显示，中剂量组8只小鼠中有5只体重明显大于其他组。

表1 各实验组荷瘤小鼠体重变化

2.2 肿瘤重量、体积及抑瘤率

剥离肿瘤时可见生理盐水组肿瘤较大，颜色较鲜艳，有较多红色液体，黏连严重。与生理盐水组比较，中剂量组肿瘤颜色较浅，坏死区较大，炎性渗出物多，部分肿瘤包膜完整，与周围组织黏连较轻；高剂量组肿瘤坏死区大，豆腐渣样组织较多，有臭味，黏连严重。肿瘤体积结果显示，中剂量组肿瘤体积第3～8天呈增加趋势，且增加速度快，第8～12天变化较小；其他各组肿瘤体积持续增加，第3天后增加更快。肿瘤重量结果显示，中剂量组约50 %的肿瘤重量比其他组小。中剂量组肿瘤重量与生理盐水组、低剂量组和高剂量组比较均有统计学意义(P=0.006，P=0.015，P=0.041)。根据抑瘤率计算公式计算可得C.novyi-NT低剂量组、中剂量组和高剂量组的抑瘤率分别为8.49%、44.59%和14.84%(表2)。

表2 各实验组肿瘤重量、体积及抑瘤率(N=8)

2.3 肿瘤和主要脏器细菌培养及鉴定

剥离的肿瘤及脏器组织涂片后行革兰染色，肿瘤组织标本油镜下可见大量棒状或杆状细菌，被染成紫色，其他组织标本未观察到C.novyi。肿瘤及脏器组织细菌培养结果显示，接种肿瘤组织的平板内见可疑C.novyi菌落外，高剂量组肝组织标本见可疑C.novyi，其他组织标本均未见C.novyi菌落。菌落行革兰染色，油镜观察显示肿瘤组织标本有大量C.novyi，高剂量组肝脏标本有少许可疑C.novyi。提取各组织DNA，测定DNA浓度后，再经PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳结果显示除肿瘤组织标本有阳性条带外其余均无阳性条带。

2.4 肿瘤和主要脏器组织HE染色

小鼠皮下肿瘤组织行HE染色后光学显微镜下观察，可见肿瘤细胞形态多样，大小不一，核深染，核大小、形态、染色不一，核浆比例增大。生理盐水组未见明显组织坏死；C.novyi-NT组均可见组织坏死，中剂量组坏死组织呈粉染、不规则颗粒状，边界不规则，边缘见慢性炎性细胞浸润；高剂量组坏死组织伴少量慢性炎细胞浸润和出血(图1)。肝、肺、肾组织HE染色均未见肿瘤转移灶。

2.5 脾脏指数和胸腺指数

完整剥离脾脏和胸腺，肉眼可见部分小鼠的脾脏明显增大。生理盐水组、C.novyi-NT低剂量组、中剂量组和高剂量组脾脏平均质量依次增大，分别为(0.284±0.076)g、(0.383±0.108)g、(0.441±0.177)g和(0.636±0.137)g，中剂量组、高剂量组与生理盐水组脾脏质量比较差异有统计学意义(P=0.022，P<0.001)，高剂量组、中剂量组和低剂量组脾脏质量比较差异有统计学意义(P=0.004，P=0.017)。生理盐水组、低剂量组、中剂量组和高剂量组脾脏指数分别为(0.954±0.266)、(1.230±0.359)、(1.463±0.596)和(2.183±0.405)，高剂量组脾脏指数明显大于其他组，与生理盐水组、低剂量组、中剂量组脾脏指数比较差异均有统计学意义(P<0.001，P=0.001，P=0.003)，中剂量组与生理盐水组脾脏指数比较差异也有统计学意义(P=0.026)。C.novyi-NT中剂量组胸腺平均质量最大，生理盐水组、C.novyi-NT低剂量组、中剂量组和高剂量组胸腺质量分别为(0.162±0.034)g、(0.147±0.019)g、(0.167±0.028)g和(0.118±0.017)g，高剂量组胸腺平均重量最小，与生理盐水组和中剂量组比较差异有统计学意义(P=0.004，P=0.001)。生理盐水组、C.novyi-NT低剂量组、中剂量组和高剂量组胸腺指数分别为(0.520±0.118)、(0.500±0.101)、(0.566±0.093)和(0.422±0.008)，各组间比较差异均无统计学意义(P>0.05)。

图1 各实验组肿瘤组织HE染色(×200)

3 讨 论

肝癌是我国最常见的五大恶性肿瘤之一，其死亡率居恶性肿瘤第二位[12]。我国每年新发肝癌病例数占全球总数的50%左右，肝癌已成为严重威胁人类健康和制约社会发展的重大问题[13]。手术、化学药物治疗、放射治疗、射频消融等仍是肝癌治疗的主要手段，但都不能显著延长患者的生存周期[14]。肝癌的既往研究主要集中在癌细胞本身，包括癌细胞基因和抑癌基因的改变、分化程度和表型的改变等。随着研究的深入，发现肝癌的微环境在肝癌的发生、发展及预后中同样起着非常重要的作用[15-18]。氧含量低、血供差是肝癌微环境的普遍特征。药物需要随血液到达作用部位，且要达到一定的浓度才能发挥杀肿瘤细胞的作用，放射线也需要氧发挥细胞毒性作用[19]。氧含量低、血供差的特殊微环境有利于肿瘤细胞的生存和转移，而限制了传统的肿瘤化学药物和放射治疗方法[20]。研究者们开始思考，能否破坏或有效地利用此特殊的微环境呢？1813 年，Vautier观察到肿瘤患者感染气性坏疽后，肿瘤生长减缓甚至消退，这一现象引起了人们对细菌抗肿瘤的关注。Coley等[21]做出了积极的探索，卡介苗已成功用于临床治疗浅表性膀胱癌。2001年，Dang等[7]从26株细菌中筛选出野生型C.novyi具有高度肿瘤靶向定植能力，后续研究发现C.novyi-NT具有强大的溶瘤效应。

既往研究中，有研究者选择了C.novyi-NT静脉注射[7-9,11,22]，另有研究者则选择了瘤内注射[7,10]。静脉注射容易产生全身反应(25%～30%)，到达肿瘤部位的细菌太少[9]。同时，部分细菌在血液中丢失或死亡，无法有效发挥抗肿瘤作用，而瘤内直接注射就解决了此问题。此外，瘤内注射比传统的局部治疗(如手术、放疗)更简单，易操作。瘤内注射C.novyi-NT还能引起局部炎症反应和抗肿瘤免疫反应[9]。所以，本研究选择的是瘤内注射途径。

肝癌是消耗性疾病，荷瘤小鼠重量变化可以反映小鼠自身状况(体重)和肿瘤重量变化的最终结果。荷瘤小鼠重量变化显示，C.novyi-NT中剂量组小鼠重量前8天呈增加趋势，随后小鼠重量变化不大，可能是细菌定植后，发挥溶瘤作用，肿瘤生长受抑制或变缓，小鼠体重降低减慢的结果。而高剂量组小鼠重量前3天呈下降趋势，随后持续快速增加，可能是因为C.novyi-NT剂量太大，发挥溶瘤作用迅速，产生的大量代谢产物及导致的强烈炎症反应对小鼠产生不良影响，此变化趋势与小鼠一般情况(高剂量组最差)和肿瘤局部变化一致。小鼠体重结果显示，高剂量组显著低于生理盐水组和中剂量组。肿瘤大范围较快地溶解，易引起严重的毒血症，出现肿瘤溶解综合征，甚至导致实验动物死亡[5]。这可能是高剂量组小鼠一般情况差的原因。

按照抗肿瘤药物药效学指导原则，只有当抑制率>30%才能评定该药物对肿瘤有一定疗效。本实验结果显示中剂量组抑瘤率达44.59%，而其他组均低于30%，所以可以判定中剂量C.novyi-NT对免疫正常小鼠皮下H22移植瘤有疗效。

研究C.novyi抗肿瘤效应，细菌的转移是不可忽视的问题。本研究中，各组小鼠的肝、脾、肺、肾、脑组织DNA鉴定均未发现C.novyi定植，但高剂量组肝脏标本细菌培养和革兰染色可见可疑C.novyi，分析其原因可能是操作污染所致或因剂量太大少量细菌经血液到达肝脏，但经肝组织细菌DNA提取后PCR检测无C.novyi，可以判定C.novyi-NT瘤内注射是安全的。C.novyi能选择性地靶向定植于H22移植瘤的乏氧区，而不转移至其他组织的可能原因有：肿瘤细胞生长速度快，而瘤内血管形态不规则，血流紊乱，导致肝癌内部缺氧，形成乏氧微环境，为C.novyi生长繁殖提供了理想条件；肿瘤细胞代谢旺盛，产生大量代谢产物，为C.novyi生长提供了丰富的营养物质，C.novyi在瘤内比正常组织的增殖能力更强，更易在肿瘤内富集；肝癌血管分布和结构异常、肿瘤组织间隙的高压使瘤内免疫细胞、抗体、补体等数量减少，功能的发挥受到抑制，C.novyi在瘤内较难被免疫系统识别、清除[5]。

免疫器官质量的变化可作为判断药物对免疫系统影响的指标之一。本研究分析了各组胸腺、脾脏的质量及胸腺、脾脏指数的差异，结果显示中剂量组脾脏质量和指数显著大于生理盐水组。脾脏质量和指数不能完全反映免疫系统的活化程度，但脾脏是B细胞发育、分化的场所，B细胞与体液免疫有关，后续实验应借助流式细胞术检测免疫细胞亚群，全面评价诺维氏梭菌瘤内注射后对H22移植瘤小鼠免疫系统的影响。

综上所述，C.novyi-NT能选择性地定植于肝癌乏氧区，中剂量(1.0×108/mL，0.5 mL)C.novyi-NT能有效抑制免疫正常小鼠H22皮下移植瘤。C.novyi-NT抗H22移植瘤的作用机制可能是细菌局部定植肿瘤乏氧区后，其菌体成分和代谢产物本身具有细胞毒性，直接对肿瘤细胞发挥杀伤作用，也可能是C.novyi诱发肿瘤相关炎症反应和抗肿瘤免疫反应间接发挥杀伤肿瘤细胞的作用[5,23]。C.novyi能在肿瘤组织中优先增殖，与肿瘤细胞竞争微环境中的营养素和生长因子；C.novyi分泌的蛋白水解酶、脂肪酶等破坏肿瘤细胞；细菌代谢产物(如磷脂酶C、脂质体酶、毒素)破坏肿瘤微环境[24]；C.novyi菌体成分刺激白细胞增殖分化，诱发TNF-α等细胞因子的释放，从而增强小鼠的免疫应答能力；C.novyi聚集于肿瘤部位，引起局部炎症反应，富集大量特异性与非特异性免疫效应细胞，诱导了与肿瘤抗原有关的交叉免疫以及抗肿瘤免疫反应。肝癌的治疗方法包括肝切除术、肝移植、经导管动脉化疗栓塞术、射频消融、分子靶向治疗等，但总体疗效并不高[25]。本研究丰富了C.novyi抗肿瘤的种类，拓展了肿瘤生物治疗的新思路，为深入探讨C.novyi治疗肝癌奠定了重要基础，后续将围绕乏氧微环境及炎症反应和抗肿瘤免疫探索其可能的机制。

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