外周血单个核细胞miR-143表达对STEMI患者急诊PCI术后1年发生支架内再狭窄的预测价值

赵玉君，孙宏超，王翠平，董自平，路桂杰

(1.任丘市人民医院 心内科，河北 任丘 062552；2.华北石油总医院 急诊科，河北 任丘 062552)

经皮冠状动脉介入(percutaneous coronary intervention，PCI)是冠心病患者一个里程碑式的治疗方法，然而部分患者在PCI术后1年内会发生支架内再狭窄(in-stent restenosis，ISR)，尤其是裸金属支架ISR发生率较高，虽然使用药物洗脱支架可将ISR的发生率降低到5%～10%，但是仍不可避免[1]。球囊和支架可引起血管损伤进而导致动脉平滑肌细胞过度增殖，此外包被剂的非细胞特异性特征也损害内皮细胞，从而导致血栓形成或动脉粥样硬化，造成晚期治疗失败[2]。最近的研究表明，一些微小RNA(microRNAs，miRNAs)可以作为预测或诊断疾病及不良事件的生物标志物[3]。miR-143是miRNAs家族的成员，位于5号染色体上，在血管平滑肌中大量存在[4]。已有研究证明，miR-143水平与诱导平滑肌细胞抗动脉粥样硬化表型有关[5]。孟霖霖[6]发现循环miR-143/145水平与冠状动脉病变严重程度呈负相关，可反映冠脉狭窄程度。然而关于miR-143是否参与动脉内皮细胞缺损尚缺乏直接的证据支持。基于上述信息，本研究旨在通过前瞻性研究，探讨外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)中miR-143表达对ST 段抬高型心肌梗死(ST-segment elevation myocardial infarction，STEMI)患者急诊PCI术后1年发生ISR的预测价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取72例2019年3月至10月在任丘市人民医院接受急诊PCI术的STEMI患者作为研究对象，并定期随访至少1年，进行前瞻性巢式病例对照研究。以入院首次进行急诊PCI作为研究起点，以随访期间发生ISR作为研究终点；采用巢氏病例对照研究法，将ISR患者定义ISR组。每当发生1例ISR，立即同时以患者年龄、性别、体重指数等基线信息作为匹配条件，按照1∶1从同队列中选择匹配的患者作为对照组。最终ISR组33例患者，非ISR组39例患者。经冠状动脉造影证实ISR的诊断。冠状动脉再狭窄定义为支架段再狭窄超过血管直径的50%[7]。在PCI术后3 h内采集血液样本，研究对象具有详细和可追溯的医疗记录，包括血生化、心电图、冠状动脉造影、心胸外科手术报告等，STEMI在患者的医疗诊断记录中得到确认。排除标准：再狭窄诊断前再次植入支架者，患有严重的肝肾功能不全、感染、肿瘤、心力衰竭、透析、结缔组织疾病等患者。应用血管内超声(intravascular ultrasound，IVUS)观察病理血管的变化。本研究经我院伦理委员会批准，所有患者均知情同意。

1.2 提取PBMCs并采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测PBMCs中miR-143含量

清晨空腹取5 ml外周静脉血，用抗凝剂乙二胺四乙酸(EDTA)处理。用淋巴细胞分离液经Ficoll密度梯度离心分离，-80 ℃保存。37 ℃下快速复活，用无菌磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗两次。离心后吸去细胞上清，制备PBMCs供进一步使用。用Trizol(美国Invitrogen公司)从PBMCs中提取总RNA，使用紫外Nandodrop2000®分光光度计(美国Thermo Fisher公司)测定总RNA的浓度和纯度，以总RNA为模板进行逆转录，并在-80 ℃低温保存。每个样品都重复分析3次。采用Taqman advanced mirna assay 和Taqman fast advanced master mix试剂盒(德国Qiagen公司)进行PCR扩增。循环条件：95 ℃ 20 s，60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s，共40个循环。用2-ΔΔCt法以U6为内参计算miR-143的相对表达量。miR-143正向引物5′-AGTGCGTGTCGTGGAGTC-3′，反向引物5′-GCCTGAGATGAAGCACTGT-3′；U6正向引物5′-GACGAATACCGGCGTGAGAA-3′，反向引物5′-AAATTCTGTTTGCGGTGCGT-3′。

1.3 其他实验室指标检测

每个受试者在我院检验科用分离胶促凝管取全血3 ml，使用离心机在2～8 ℃、2 000 r·min-1条件下处理30 min，分离血清，保存在-20 ℃或-80 ℃条件下，避免反复冻融处理。用ELISA试剂盒(上海通蔚生物公司)测定血清B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、白细胞介素(interleukin，IL)-6、IL-8、IL-10、IL-1β、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)的水平。以水平轴为标准品浓度，垂直轴为光吸收值，用相关软件绘制标准曲线，计算待测指标水平，严格按照试剂盒说明书进行操作，试验前所有试剂混合均匀。

1.4 统计学处理

2 结 果

2.1 两组STEMI患者一般资料的比较

两组患者的年龄、性别构成、高危因素(高脂血症史、高血压史、吸烟史和饮酒史)、体重指数、收缩压(systolic blood pressure，SBP)、舒张压(diastolic blood pressure，DBP)、高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、甘油三酯(triglyceride，TG)、随访期间用药史等差异均无统计学意义(P>0.05)；ISR组患者糖尿病史比例、血糖、低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)高于非ISR组，支架长度长于非ISR组，支架直径小于非ISR组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 两组患者一般资料的比较

2.2 PBMCs中miR-143水平与ISR发生的相关性

与非ISR组(1.00±0.14)相比，ISR组患者PBMCs中miR-143相对表达量(0.62±0.21)显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。单因素和多因素 Logitic回归分析显示，排除5个临床因素(糖尿病史患者比例、血糖、LDL-C、支架长度、支架直径)干扰后，miR-143与ISR的发生风险有关(OR=6.367，95%CI2.434～13.679，P<0.05)。

2.3 PBMCs中miR-143表达对STEMI患者急诊PCI术后1年发生支架内再狭窄的预测价值

经ROC曲线分析发现，PCI术后PBMCs中miR-143表达预测STEMI患者急诊PCI术后1年发生支架内再狭窄的AUC为0.954(95%CI0.910～0.998)，cut-off值为0.795，在该阈值下灵敏度和特异度分别为94.9%和81.8%。见图1。

图1 PBMCs中miR-143表达预测STEMI患者急诊PCI术后1年发生支架内再狭窄的ROC曲线

2.4 两组患者血清Bcl-2、IL-6、IL-8、IL-10、IL-1β、TNF-α水平的比较

ISR组患者血清Bcl-2和IL-6水平高于非ISR组，差异有统计学意义(P<0.05)；两组患者血清IL-8、IL-10、IL-1β和TNF-α水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 两组患者血清Bcl-2、IL-6、IL-8、IL-10、IL-1β、TNF-α水平比较 pg·ml-1

2.5 PBMCs中miR-143表达与血清Bcl-2、IL-6水平的相关性

ISR组患者PBMCs中miR-143相对表达量与血清Bcl-2、IL-6水平呈负相关性(r=-0.739、-0.646，P<0.05)，血清Bcl-2水平与IL-6水平呈正相关性(r=0.801，P<0.05)。见图2。

图2 ISR组患者PBMCs中miR-143表达与血清Bcl-2、IL-6水平的关系

3 讨 论

目前急诊PCI术是临床治疗 STEMI 的最有效方法，STEMI 患者在接受 PCI 手术后冠状动脉的血流恢复，预后改善，但是ISR依然是PCI治疗技术的致命弱点[8]。近年来，尽管我们已经对ISR进行了临床和基础研究，并在风险预测、预防和治疗方面取得了重大进展，然而强化的抗血小板和他汀类药物治疗以及严格的术后处理似乎不能有效预防部分患者ISR的发生。因此越来越多的学者开始考虑基因方面的原因[9]。miRNAs是一类进化上高度保守、内源性单链、非编码的小分子RNA，因其在循环血液中的稳定性以及相对的细胞和(或)组织特异性，为检测遗传背景差异提供了一种简便的方法。miR-143位于人类5号染色体上，在造血、免疫、炎症、癌症和心血管疾病中发挥重要作用。Zhou等[10]研究发现，miR-143与脓毒症患者免疫炎症反应密切相关。PBMCs是从外周血中分离出来的单个核细胞，由 T、B淋巴细胞，巨噬细胞和自然杀伤细胞组成，在免疫应答中起着重要作用。在本研究中，我们发现ISR组患者PBMCs中miR-143相对表达量低于非ISR组，miR-143表达降低的STEMI患者PCI术后存在较高的ISR发生风险，与其他因素无关。

ISR的基本机制是血小板、白细胞和巨噬细胞聚集，导致中膜平滑肌细胞迁移和增殖。最近，研究人员发现约1/3的ISR事件是由于支架内新生动脉粥样硬化，这明显不同于传统的机制[11]。然而，在这些机制中确实存在一个共同的现象，即ISR和支架内新生动脉粥样硬化。以往的研究证实，miR-143在血管平滑肌细胞中呈高度特异性表达，并且在VSMCs的增殖和迁移过程以及动脉功能中发挥重要作用[12]。而且在冠状动脉受损或动脉粥样硬化的动物模型中，如ApoE基因敲除小鼠的动脉粥样硬化、小鼠结扎诱导的颈动脉和大鼠颈动脉球囊损伤中，miR-143表达同样显著下降[13]。miR-143是位于人类5号染色体上的多功能 miRNA。Zhang等[14]证实 miR-143通过促进记忆T细胞分化和代谢重编程，增强T细胞的抗肿瘤作用；Vatandoost等[15]证实PBMCs与全身器官保持密切的联系，因此可能表现出与胰岛素靶器官有关的 miR-143改变，与正常健康对照组相比，糖尿病前期和明显糖尿病期患者PBMCs中miR-143表达显著降低。上述研究均证实miR-143与炎症及免疫密切相关，可调节免疫细胞的活化和免疫因子的释放。本研究中我们也证实ISR患者血清PBMCs中miR-143相对表达量较非ISR组患者降低，并且miR-143低表达是STEMI患者PCI术后发生ISR的独立危险因素。这些结果提示 miR-143参与了动脉粥样硬化的免疫炎症反应机制。

成熟的 miRNA是由一系列核酸酶切断长初始转录物而产生的。miR-143是 miRNA分子的一种，而Bcl-2是miR-143的直接靶向因子。陈玉婷等[16]研究证实，冠心病患者PCI术后血清Bcl-2水平明显升高，且血清Bcl-2高表达可能是ISR的一个重要原因，药物综合治疗可使冠心病患者血清Bcl-2表达下调，进而有效地预防ISR的发生。ISR的发生与血管平滑肌细胞过度增殖和炎症刺激有关。Elia等[17]体外和动物研究发现，miR-143表达缺失可导致血管平滑肌细胞分化不完全，进而引起主动脉结构改变，说明miR-143在平滑肌细胞分化过程中起着关键作用，并强烈提示它参与了平滑肌细胞分化表型的逆转，这种逆转发生于平滑肌细胞分化过程中的多种血管疾病，包括ISR[18]。本研究中，我们发现PBMCs中miR-143低表达与血清Bcl-2和IL-6高表达有关，说明miR-143低表达可能是引起血管平滑肌细胞凋亡及血管内皮炎症反应的重要机制之一。

综上所述，STEMI患者PBMCs中miR-143低表达是PCI术后1年发生ISR风险的独立危险因素，其表达水平降低与血清Bcl-2和IL-6水平升高有关，因此上调PBMCs中 miR-143表达有望成为一个有效预防ISR的靶点。但是本研究存在一定的局限性，例如我们无法确定药物治疗对miR-143水平的影响，从而导致本结果可能存在一定偏差。进一步的研究应该旨在揭示某些药物治疗与PBMCs中miR-143水平变化及相关预后的关系。