RBM10,Caspase-9和内皮一氧化氮合成酶(eNOS)在早中期胚胎蜕膜组织的表达①

闫风智,刘 瑶,蒋 立,任亚萍,杨 森,卢德杰

(桂林医学院a.基础医学院;b.临床医学院;c.组织学胚胎学教研室,广西 桂林 541199)

妊娠过程极其复杂,子宫蜕膜化作为整个妊娠周期的关键步骤,是胚胎植入成功的前提并决定着后期滋养细胞的侵袭程度,在一定程度上对后期胚泡着床、胎盘形成等一系列过程起到精确调控作用[1]。细胞为适应机体生长发育的需求而进行的自我淘汰过程称为凋亡,这种程序性细胞死亡模式补充了经典的半胱天冬氨酸蛋白酶介导的凋亡模式[2],而且细胞凋亡在整个妊娠周期中都发挥了极其重要的作用。RBM10基因是位于X染色体上的RNA结合蛋白和凋亡相关基因的剪接调节剂[3]。RBM10的表达诱导细胞凋亡、抑制细胞增殖[4],在细胞凋亡的进程中,caspase-9作为线粒体凋亡通路的起始因子,caspase-9的释放可激活下游的凋亡因子,最终导致活化的半胱天冬蛋白酶发生层叠级联反应引发细胞凋亡[5]。故本实验研究探讨RBM10、caspase-9和eNOS在孕鼠早中期蜕膜组织表达及意义。

1 材料与方法

1.1 实验动物

雌性未交配的昆明鼠35只(SPF级),鼠龄(49±2)d,体重25.0~30.0 g;雄性昆明鼠6只,鼠龄(56±2)d,体重40.0~50.0 g左右(均购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司,SPF级)。动物饲养于光照周期为12 h开灯,12 h关灯的明暗变化环境中,每天光照时间段为6∶00~18∶00,相对湿度35.0%~45.0%,室温保持24℃左右,可自由采食、饮水(饮用水经过消毒处理)。本研究获得桂林医学院实验动物委员会的批准。

1.2 实验材料

RBM10、caspase-9以及内皮型一氧化氮合酶(eNOS)的兔抗鼠多克隆抗体(均购自北京中杉金桥);瑞氏染液(安徽雷根生物);中性树胶(珠海贝索生物);乙醇,石蜡,福尔马林DAB(北京中杉金桥);包埋器、石蜡切机、染色操作台、恒温水浴锅;显微镜(日本奥林巴斯)。

1.3 实验方法

1.3.1 受孕与组织标本采集 将昆明小鼠放入桂林医学院动物房饲养1周后,于第1天晚上用阴道脱落物做阴道脱落细胞检查:用消毒棉签粘取少量生理盐水轻轻插入雌鼠阴道轻转一圈,取出棉签涂抹在载玻片上,滴加2~3滴甲醇固定,待载玻片风干后,滴加2滴瑞氏染液染色3 min,再滴加PBS缓冲液(pH=7.0)混匀,10 min后,轻甩去掉玻片上染液,自来水冲洗30 s,自然风干后封片,显微镜下观察。以观察到阴道脱落细胞中出现大量角化上皮细胞,并且极少见炎症细胞者为合笼最佳时机小鼠。

雌鼠进入发情周期时将雌雄鼠按4∶1合笼,第2天清晨进行察看,看到白色阴道栓即确定为孕鼠,记为妊娠第1天,随机抽取6.5~9.5 d孕鼠进行取材。采用颈椎脱臼法将孕鼠处死,于腹部正中线耻骨联合上方0.5 cm处切开暴露子宫及输卵管,用手术器械将子宫颈及输卵管剪断并且将其完整取出,同时将断端结扎,标本放置入包埋液中固定保存,标注日期、序号。

1.3.2 免疫组织化学检测 36%的中性甲醛固定子宫组织24 h,石蜡包埋组织后连续切片(5μm),60℃恒温箱烤片1 h左右脱蜡,乙醇水化后蒸馏水冲洗1次,时间1 min,用乙二胺四乙酸抗原修复组织切片,蒸馏水冲洗,阻断内源性过氧化物酶10 min,PBS洗3次,5 min/次,BSA封闭30 min,然后加入稀释好的一抗(RBM10稀释度1∶200,eNOS稀释度1∶100,caspase-9稀释度1∶50)50μl,37℃孵育1 h,用PBS(pH=7.4)冲洗3次,5 min/次,加入二抗37℃孵育30 min后,用PBS缓冲液冲洗3次,5 min/次,加DAB液(100μl)显微镜下观察,显色后用蒸馏水冲洗切片,苏木素复染30 s,自来水冲洗10 min,酒精梯度脱水,分别为75%酒精5 min,85%酒精5 min,95%酒精5 min,100%酒精8 min,然后二甲苯透明2×10 min后,放于通风厨中风干,树胶封片,显微镜下观察并采集图片,之后用IPP 6.0版本图像软件标记,测定各组光密度值即为各组蛋白的相对表达量。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 RBM10、caspase-9与eNOS在组织中的表达定位

Caspase-9集中表达于蜕膜组织的腺上皮细胞胞质及部分基质细胞的胞质;RBM10表达于蜕膜细胞的细胞核,合体滋养层细胞胞核,腺细胞胞核,基质细胞胞核;eNOS在基蜕膜细胞胞质呈弱阳性表达。表达阳性为染色呈棕褐色、棕黄色。见图1。

图1 免疫组织化学检测RBM10,Caspase-9和eNOS的表达(20×)

2.2 RBM10,caspase-9与eNOS表达量

Caspase-9在孕鼠8.5 d的蜕膜组织中表达高于6.5 d、9.5 d(P<0.05);RBM10在孕鼠8.5 d的子宫蜕膜中表达高于6.5 d,且在8.5 d时达高峰后下降,9.5 d时的表达低于8.5 d(P<0.05);eNOS在孕鼠蜕膜化的6.5 d、8.5 d和9.5 d时,呈弱阳性表达,且8.5 d时的表达水平高于9.5 d(P<0.05)。见图2。

图2 RBM10、caspase-9、eNOS表达的灰度分析(∗P<0.05,∗∗P<0.01)

3 讨论

蜕膜化被认为是建立可接受的子宫内膜微环境以支持和维持妊娠的关键过程[6]。目前调控细胞凋亡的研究主要集中于线粒体与死亡受体两种途径[7],caspase-9是细胞凋亡线粒体通路的关键起始因子[8]。在本研究中,Caspase-9在妊娠早中期发育过程中,随胚胎发育表达逐渐升高,在8.5 d时,表达最高,但到第9.5天又很快下降,提示妊娠8.5 d时,子宫蜕膜细胞以凋亡为主。caspase-9在早中期蜕膜组织细胞中的表达变化,提示caspase-9在蜕膜形成的早期已经启动凋亡程序并为蜕膜增厚及胚胎的顺利定位做准备,但在第8.5天处于凋亡表达最高,根据增殖与凋亡的动态平衡,胚胎第8.5天也是子宫蜕膜增殖生长发育最活跃的时间点。因此,推测在蜕膜化中主要是通过caspase9的凋亡通路而引起细胞发生凋亡。RBM10在子宫蜕膜中的表达量先升高,在胚胎的8.5 d达到高峰后下降,提示RBM10在蜕膜化的早中期通过细胞的增殖与凋亡来推进妊娠过程的发展。胚胎干细胞和小鼠腭细胞因缺乏RBM10,细胞生长缓慢[9],同样说明RBM10的表达与细胞增殖有关。图2结果显示,caspase-9和RBM10呈同步变化,推测caspase-9与RBM10的表达可能具有相关性,caspase-9与RBM10共同参与早中期蜕膜化的发生,两者可能共同协调,完成蜕膜的增殖和凋亡活动,维持蜕膜化过程中蜕膜细胞及滋养细胞之间的动态平衡,使蜕膜的基质细胞、血管和腺细胞的生长发育至一定的水平,为胚胎植入及其生长发育提供了充分的准备。

蜕膜化进程中通常伴随血管改变,而这对后续胚泡着床及胎盘形成至关重要。RBM10表达与VEGF的表达增加相关,RBM10自身磷酸化也支持RBM10在调节血管生成中的作用,RBM10表达异常导致胚胎早期死亡[10]。这可能意味着RBM10参与了早中期胚胎发育过程中血管的建立。Caspase-9在基质细胞中明显高表达,随着妊娠进展基质细胞承担启动新血管形成任务。本课题组前期研究显示eNOS在滋养层细胞之间的血管、胚外中胚层细胞之间毛细血管内皮均有较强表达,而胚外中胚层细胞将发育为绒毛膜的组织,说明在胚胎着床后,NO发挥着重要作用。图1显示,eNOS表达于基蜕膜细胞胞质,随着蜕膜化进展,基蜕膜将参与胎盘形成。提示eNOS在胎盘新生血管及维持血管扩张以提供丰富血液,对促进胚胎生长发育方面具有重要意义。妊娠期间的子宫肌层内的NOS释放NO,与其他的因子共同维持孕期子宫肌层的舒张与血管构建。RBM10与caspase-9在蜕膜化过程中表达规律,提示二者可能共同参与了胚泡的着床及血管构建进程。而eNOS在妊娠早期表达量低,少量NO可能参与着床处血管壁的构建。

蜕膜化在整个妊娠阶段起到奠基作用并在其辨别胚胎质量方面发挥重要作用。敲除小鼠ES细胞中的RBM10导致细胞生长急剧下降,并影响胚状体的形成[11],提示RBM10在妊娠早期发挥重要作用。eNOS通过调节NO的含量来调控血管,NO作为细胞的信号分子,在维持子宫蜕膜化、新血管形成方面发挥作用[12]。eNOS在胚胎蜕膜组织中的表达变化,推测早期胎盘还未完全形成,血液交换较少,胚胎处于相对缺氧的环境中,随后母胎之间营养物质快速交换,循环逐步形成,此时eNOS表达水平的增加为NO合成奠定了基础。根据胚胎发育周期规律提示,caspase-9可能参与了胚胎植入与神经沟的建立过程;凋亡因子caspase-9与RBM10在胚胎蜕膜组织的表达变化规律,提示小鼠妊娠的第8.5天是非常有意义的1天,此时胚胎植入完成,蜕膜生长包裹整个胚胎,为胚胎的生长发育提供了适宜的环境及充足的营养供应。同时期小鼠的器官原基已建立,增殖的细胞可通过细胞凋亡途径来达到维持细胞的稳态环境和机体生长发育的需要。Caspase-9和RBM10在蜕膜的高表达提示凋亡因子可能参与了胚胎三胚层及神经沟的构建过程。人类妊娠过程中胚胎植入时间比孕鼠晚,人类需要更长植入过程及器官原基发育时间,而这将决定整个妊娠的质量及出生后疾病发生概率。

本研究结果说明RBM10,caspase-9和eNOS在早中期蜕膜化过程中共同调节妊娠子宫蜕膜细胞的增殖与凋亡及胚胎生长发育过程。子宫蜕膜化对于整个妊娠周期的发展起到极为关键作用,而内膜受损则会导致反复流产、不孕不育、子宫内膜疾病及子宫内膜异位症结节的发生等。凋亡因子RBM10,caspase-9在子宫蜕膜组织的表达变化类似,推测其可能具有相关性。