环状RNA circTMBIM 1在肝细胞癌中的表达和功能研究①

陆滢雪 罗新华 程明亮 彭 虹 （贵州医科大学附属医院感染科，贵阳550004）

近年来，环状RNA（circRNA）的功能备受关注，如调节亲本基因表达、发挥miRNA海绵体等作用［1-3］。研究表明，circRNA参与肿瘤发生发展［4-5］。原发性肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是全球恶性肿瘤相关死亡的常见原因，预后差、复发率高，其发病机制受到高度关注［6-7］。最新研究表明，大量circRNA在HCC组织和正常肝组织中存在差异表达，与HCC发生发展和预后密切相关，但具体作用机制尚未明确［8-10］。本文就circRNA在HCC中的异常表达进行分析，探讨其在HCC中的作用和潜在机制。高通量测序发现，circTMBIM1在HCC组织中表达上调，因此，课题组对Hsa-circTMBIM1在HCC细胞系中的表达进行RT-PCR定量分析，并设计合成靶向Hsa-circTMBIM1的小干扰RNA（siRNA），将其转染至Huh7细胞，研究Hsa-circTMBIM1与Huh7细胞增殖和迁移的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系 人HCC细胞株HepG2、Hep3B、Huh7、Sk-hep-1、HCCLM3、SMMC-7721购自上海生命科学院所；慢病毒稳转细胞株由南京科佰生物科技有限公司提供；引物由北京擎科生物有限公司合成；靶向circTMBIM1的siRNA序列委托广州锐博生物公司设计合成；

1.1.2 主要试剂与仪器 DMEM细胞培养基（美国Hyclone公司）；胎牛血清（美国Gibco公司）；青-链霉素（武汉苑陵生物科技有限公司）；miR-24-3p模拟物（上海吉玛生物有限公司）；miR-24-3p抑制剂和阴性对照（上海生工生物公司）；CCK-8试剂盒（日本Dojindo公司）；结晶紫染色液（碧云天公司）；碘化丙啶、Lipofectamine 3000转染试剂盒、荧光素酶报告基因质粒（美国Sigma公司）；Transwell小室（美国Coster公司）；Trizol试剂（美国Invitrogen公司）；酶标仪（美国Thermo公司）；Muse智能触控细胞分析仪（美国默克密理博公司）；荧光定量PCR仪（美国ABI公司）；双荧光素酶报告基因测定系统（Promega，Madison，WI，USA）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及转染 HCC细胞系HepG2、Hep3B、Huh7、Sk-hep-1、HCCLM3和SMMC-7721均采用DMEM培养基培养，添加10%胎牛血清（FBS）+100 U/ml青霉素+100μg/ml链霉素，37℃、5%CO2、95%相对湿度下培养。根据Lipofectamine3000转染试剂盒说明书转染circTMBIM1-siRNA，培养48 h后进行细胞功能实验。

1.2.2 RT-PCR 采用Trizol试剂从新鲜冷冻组织和培养细胞中分离总RNA，反应体系10μl，反应条件：25℃5 min，42℃60 min，70℃5 min，12℃ 循环，合成cDNA。扩增体系20μl，反应条件：95℃5 min，95℃5 s，60℃60 s，共40个循环。circTMBM1引物序列为：F：5′-GGCTATGATGGGGAGGAGAGAGC-3′，R：5′-GGCGCTGGGGTTGGACATGG-3′；miR-24-3p引物序列为：5′-TGCGGTGGCTCAGTTCAGCAG‐GAAC-3′；GAPDH引物序列为：F：5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，R：5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′。2-ΔΔCt法计算基因相对表达。比较circTMBIM1在HCC细胞中的表达，所有试验重复3次，取平均值。

1.2.3 细胞功能实验

1.2.3.1 细胞增殖及活性检测 100μ/l孔向96孔反应板中注入细胞悬浮液，置于培养箱中培养，10μ/l孔添加CCK-8溶液进行孵育，酶标仪测定样品450 nm处吸光度。取对数生长期细胞，4×103～1×105个/孔接种于96孔板，培养至正常生长阶段，采用细胞培养基按1 000：1比例稀释EdU溶液（试剂A），制备50μmo/lL EdU培养基，固定细胞后用Apollo试剂染色，拍照并分析图像。向6孔板中注入100个细胞，接种于培养液中并置于培养箱中培养，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时终止培养，固定细胞，加入适量结晶紫染色，流动水冲洗，空气干燥后拍照。所有试验重复3次，取平均值。

1.2.3.2 细胞创伤愈合实验 将24孔细胞培养板的细胞培养24 h至70%～80%融合度，200μl移液枪垂直划痕，冲洗脱落细胞，添加新鲜培养基培养细胞48 h，PBS清洗2次，固定细胞并测距。所有试验重复3次，取平均值。

1.2.3.3 Transwell实验 调整细胞浓度至2×105个/ml，吸取100μl无血清细胞培养基加入Transwell上室，37℃培养48 h，按照操作规范进行实验，显微镜明亮视野下观察阳性细胞，所有试验重复3次，取平均值。

1.2.3.4 流式细胞周期检测 转染24 h后弃培养基，PBS冲洗2次，加入1 ml不含EDTA的胰酶，待细胞成片脱落后，加入2 ml培养基终止消化，转移至无菌离心管，1 000/rmin离心5 min，弃上清，PBS洗涤并离心3次，预冷70%乙醇固定，4℃孵育过夜，PBS离心洗涤细胞3次，去固定液，加入缓冲液，加入0.5μg/ml PI染色液染色30 min，流式细胞术检测细胞周期，FlowJo7.6软件分析各期细胞含量。

1.2.4 慢病毒稳转细胞株构建和细胞转染 将过表达circTMBIM1的细胞（circTMBIM1 OE）、circTM‐BIM1-敲除细胞（sh-circTMBIM1）和阴性对照细胞（NC）进行慢病毒包装，构建稳转细胞株。Huh7细胞接种于6孔板，第2天采用Lipofectamine 3000转染48 h后收集细胞，qRT-PCR验证转染效率。

1.2.5 双荧光素酶报告基因试验 TargetScan和miRanda预测circRNA-miRNA的相互作用，生物信息学预测circTMBIM1与底物miR-24-3p相结合，构建psiCHECK-circTMBIM1-WT/-Mut质粒，采用Li‐pofectamine 3000将psiCHECK-circTMBIM1-WT或psiCHECK-circTMBIM1-Mut和miR-519a-5p模拟物或miR-NC共转染至293T细胞，双荧光素酶报告基因测定系统测定转染48 h后的荧光素酶活性。

1.3 统计学分析 采用SPSS17.0软件进行统计学分析，GraphPad Prism7软件绘图，两组间比较采用t检验，多组均数比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 circTMBIM1在HCC细胞系中的表达及敲减效率 circTMBIM1在Huh7细胞系中表达最高，其次分别为HepG2，Hep3B，Sk-hep-1，HCCLM3，SMMC-7721（图1A），选用Huh7细胞系进行后续实验。qRTPCR实验检测显示，与对照组相比，siRNA干扰后，circTMBIM1表达显著降低（P＜0.001，图1B）。

2.2 下调circTMBIM1对Huh7细胞增殖的影响 CCK-8实验结果显示，与对照组相比，下调circTMBIM1表达明显降低Huh7细胞增殖活力（P＜0.01，图2A）。集落形成实验研究结果显示，将circTMBIM1 siRNA转染至Huh7细胞2周后，与对照组相比，Huh7细胞集落数明显减少（图2B）。进一步采用EdU实验检测沉默circTMBIM1后Huh7增殖活力的变化，结果显示，与对照组比，沉默circTM‐BIM1可降低Huh7细胞增殖活力（图2C）。

图1 circTMBIM 1在HCC细胞系中的表达及敲减效率Fig.1 Expression and knock down efficiency of circTM⁃BIM 1 in HCC cell lines

图2 下调circTMBIM 1对Huh7细胞增殖的影响Fig.2 Effect of down-regulation of circTMBIM 1 on pro⁃liferation of Huh7 cell

2.3 下调circTMBIM1表达对Huh7细胞迁移的影响 细胞创伤愈合实验结果显示，划痕48 h后，与对照组相比，下调circTMBIM1表达显著抑制细胞创伤愈合（图3A）。Transwell细胞迁移实验结果显示，与对照组相比，下调circTMBIM1表达后Huh7细胞迁移能力减弱（图3B）。

2.4 下调circTMBIM1表达对Huh7细胞细胞周期的影响 流式细胞术检测下调circTMBIM1表达对Huh7细胞细胞周期的影响，结果显示，与对照组相比，敲低circTMBIM1表达，Huh7细胞S期占比显著降低（P＜0.05，图4）。

2.5 双荧光素酶活性检测实验证实TMBIM1与miR-24-3p结合 根据NCBI数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）查询分析，预测TMBIM1与miR-24-3p存在结合位点（图5A）。共转染circTM‐BIM1-WT和miR-24-3p模拟物后荧光素酶相对活性降低，miR-24-3p表达显著降低。转染circTMBIM1 OE后，miR-24-3p表达下降，转染sh-circTMBIM1后miRNA表达升高（P＜0.01，P＜0.001，图5B）。提示circTMBIM1可能直接与miR-24-3p结合而抑制miR-24-3P活性。

图3 下调circTMBIM 1表达对Huh7细胞迁移的影响Fig.3 Effect of down-regulation of circTMBIM 1 on mi⁃gration of Huh7 cell

图4 下调circTMBIM 1表达对Huh7细胞细胞周期的影响Fig.4 Effect of down-regulation of circTMBIM 1 on cell cycle of Huh7 cell

图5 双荧光素酶活性检测实验证实TMBIM 1与miR-24-3p结合Fig.5 Double luciferase activity test confirmed combina⁃tion of TMBIM 1 and miR-24-3p

图6 过表达circTMBIM 1可逆转miR-24-3p mimics对Huh7细胞增殖、迁移、细胞周期的影响Fig.6 Overexpression of circTMBIM 1 can reverse effects of miR-24-3p mimics on proliferation，migration and cell cycle of Huh7 cells

2.6 过表达circ TMBIM1可逆转miR-24-3p mimics对Huh7细胞增殖、迁移、细胞周期的影响 采用CCK-8法测定共转染miR-24-3p mimics和circTM‐BIM1 OE后Huh7细胞增殖情况，结果显示，miR-24-3p mimics可抑制Huh7细胞增殖，而过表达circTM‐BIM1可逆转miR-24-3p mimics对Huh7细胞增殖的抑制作用（图6A），集落形成实验结论相同（图6B）。细胞创伤愈合实验、Transwell实验共转染miR-24-3p mimics和circTMBIM1 OE后Huh7细胞迁移结果显示，miR-24-3p mimics可抑制Huh7细胞迁移，而过表达circTMBIM1可逆转miR-24-3p mimics对Huh7细胞迁移的抑制作用（图6C、D）。流式细胞术实验结果显示，与对照组相比，下调circTMBIM1表达细胞S期占比降低，共转染circTMBIM1 OE结论相反（图6E）。

3 讨论

HCC是一种死亡率较高的恶性肿瘤，预后差、恶性程度高、复发率高，对多种化疗药物耐药，若发生恶性转移控制较难［11-12］。进一步筛选潜在诊断、预后生物标志物和治疗靶点，深入研究可能的分子机制对HCC治疗至关重要。近年非编码RNA（ncRNA）已成为HCC研究重点。多项研究表明，肿瘤特异性ncRNA可用于生存预测和治疗干预［13-15］。HCC相关ncRNA中，circRNA在HCC发生发展中具有重要作用［16］。circRNA/miRNA轴在转录和转录后水平调节基因表达［17］。研究表明，circRNA可与多种miRNA结合起miRNA“海绵体”作用，影响其他基因转录和翻译，调控肿瘤恶性进展，如circ‐MTO1和cSMARCA5已被认为是致癌miRNA海绵，在HCC进展过程中发挥重要作用，可能成为HCC治疗的潜在靶点［18-20］。

本研究发现circTMBIM1在HCC细胞中表达显著上调，敲低circTMBIM1可使HCC细胞增殖及迁移能力减弱。生物信息学数据库分析显示circTM‐BIM1与miR-24-3p存在结合位点，荧光素酶报告基因实验验证结合位点的结合能力。circTMBIM1/miR-24-3p信号轴的潜在下游基因主要参与细胞代谢过程，与HCC细胞代谢失调相关。circTMBIM1可能通过影响Huh7细胞代谢调控miR-24-3p的下游基因，从而促进Huh7细胞增殖、迁移。因此circTM‐BIM1可能是HCC的潜在治疗靶点。本研究仍存在一定局限性，样本量较小，需要招募更多患者进一步阐明circTMBIM1的临床意义，且未涉及miR-24-3p的下游基因。circTMBIM1在体内的致癌作用及合成和降解机制有待进一步研究。

综上所述，本研究首次探讨了circTMBIM1在人HCC细胞中的生物学功能，证明circTMBIM1在HCC发生发展中起重要作用。此外，circTMBIM1的致癌作用可能与miR-24-3p的抑制有关，circTMBIM1可能成为HCC治疗的有效靶点。