lncRNA PCGEM 1对尘螨抗原浸出物刺激后支气管上皮细胞增殖、凋亡及炎症的影响①

陈咏丽 董善武 蒋 姝 刘 娜 陶 双

（武汉市第四医院，华中科技大学同济医学院附属普爱医院儿科，武汉430030）

支气管哮喘是近年备受关注的全球公共卫生问题，也是儿童最常见的慢性疾病，以气道反应性增强、气道发炎和气道重塑为特征［1］。近年来，儿童哮喘发病率呈升高趋势，已严重影响儿童的健康和生长发育［2］。因此，对儿童哮喘的早期诊断和干预具有重要意义。近年研究显示，长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）在哮喘的进展中发挥重要生物学作用，靶向lncRNA是治疗哮喘的新方向［3］。前列腺癌基因表达标记物1（prostate can‐cer gene expression marker 1，PCGEM1）基因位于染色体2q32.3，研究显示PCGEM1在前列腺癌、结肠癌等恶性肿瘤中表达上调，干扰PCGEM1可抑制肿瘤细胞的增殖和迁移，是恶性肿瘤的潜在治疗靶点［4-5］。对哮喘患者血清中差异性表达的lncRNA进行初步筛选发现，PCGEM1呈低表达，是临床检测哮喘潜在的新型分子标记物［6］。支气管上皮细胞是气道抵抗外部环境的物理屏障，其功能障碍在哮喘的发病机制中起重要作用，但PCGEM1对哮喘患者支气管上皮细胞增殖、凋亡的影响尚未见报道。因此，本研究以尘螨抗原浸出物刺激支气管上皮细胞，通过检测PCGEM1的表达及细胞增殖、凋亡及炎症反应变化，初步探讨PCGEM1在支气管哮喘中的作用，以期为支气管哮喘的治疗提供新途径。

1 材料与方法

1.1 材料 人支气管上皮细胞16HBE购于美国典型菌株保藏中心；MEM培养基和胎牛血清购于美国Gibco公司；安脱达（尘螨抗原提取物）购于丹麦ALKAbello A/S公司；LipofectamineTM2000购于美国Invit‐rogen公司；小干扰RNA阴性对照（si-NC）、PCGEM1小干扰RNA（si-PCGEM1）、空载体（pcDNA3.1）、PC‐GEM1过表达载体（pcDNA3.1-PCGEM1）及PCR引物购于南京金斯瑞生物科技有限公司；TRIzol试剂、RIPA裂解液、四甲基偶氮唑蓝（methyl thiazolyl tetra‐zolium，MTT）试剂盒、膜联蛋白V异硫氰酸荧光素/碘化丙啶（Annexin V-FITC/PI）细胞凋亡检测试剂盒购于北京索莱宝生物科技公司；胸腺基质淋巴细胞生成素（thymostromal lymphocytin，TSLP）、ELISA试剂盒购于武汉华美生物工程有限公司；兔源Cyclin D1、P21、B细胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/leu‐kaemia-2，Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）、磷酸甘油醛脱氢酶（phosphoglyceral‐dehyde dehydrogenase，GAPDH）抗体以及上样抗兔Ⅱ抗为美国Abcam公司产品。

1.2 方法

1.2.1 细胞分组和处理 采用含有10%胎牛血清的MEM培养基培养16HBE，培养箱条件设置为37℃、CO2体积分数5%。当细胞生长融合度为90%时进行胰酶消化和传代。取对数期16HBE进行实验，将16HBE以1×105个/孔接种于6孔板，当细胞生长融合度达到70%时，采用300 U/L安脱达刺激细胞24 h标记为尘螨抗原浸出物［7］。正常培养的16HBE细胞标记为对照组。为证实PCGEM1对尘螨抗原浸出物刺激支气管上皮细胞增殖、凋亡和炎症因子分泌的影响，参照脂质体LipofectamineTM2000使 用 说 明 分 别 将si-NC、si-PCGEM1、pcD‐NA3.1、pcDNA3.1-PCGEM1转染至16HBE，经安脱达刺激24 h后，检测细胞增殖、凋亡及炎症因子分泌情况。

1.2.2 qRT-PCR检测PCGEM1的表达水平 TRIzol法提取各组16HBE细胞的总RNA，紫外分光光度法测定RNA的浓度和纯度，将RNA逆转为cDNA，并以cDNA为模板进行qRT-PCR扩增。PCGEM1上游引物序列为5′-CACGTGGAGGACTAAGGGTA-3′，下游引物序列为5′-TTGCAACAAGGGCATTTCAG-3′；GAPDH上游引物序列为5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′，下游引物序列为5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′。以GAPDH为内参照，用2-ΔΔCt法计算PCGEM1的相对表达量。

1.2.3 MTT法检测细胞活力 将16HBE以2×103个/孔接种于96孔板，按照1.2.1分组进行相应细胞处理后，分别在24、48、72 h时间点向各孔加入20μl质量分数为5 mg/ml的MTT试剂，培养箱继续孵育4 h，弃去孔内上清液，再向各孔加入150μl DMSO孵育2 h，当结晶完全溶解后，全自动酶标仪检测各孔吸光度值。

1.2.4 流式细胞术检测细胞凋亡 收集按照1.2.1分组处理的各组细胞，PBS液洗涤细胞后，加入适量的结合缓冲液悬浮细胞，调整细胞浓度约为1×106个/ml，取100μl细胞悬液加入流式管，加入5μl Annexin V-FITC，轻轻地混匀后，室温避光孵育10 min，加入5μl碘化丙啶（propidium iodide PI），室温避光孵育5 min，补加结合缓冲液至500μl，轻轻混匀，1 h内用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.2.5 ELISA检测TSLP和TNF-α水平 16HBE按照1.2.1分组进行相应处理后，分别收集各组细胞上清液，以3 000/rmin 4℃离心15 min，收集上清，参照ELISA试剂盒说明书检测TSLP和TNF-α水平。

1.2.6 Western blot检测Cyclin D1、P21、Bax和Bcl-2的蛋白表达 收集按照1.2.1分组处理的各组细胞，RIPA裂解液提取各组细胞总蛋白，测定蛋白浓度和纯度。取适量细胞蛋白和等体积上样缓冲液混合后，煮沸5 min使细胞蛋白充分变性。取30μg已冷却至室温的蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离细胞蛋白，结束后将蛋白湿法转移至硝酸纤维素膜。采用5%脱脂牛奶室温条件封闭膜1 h，TBST洗膜后，加入已稀释的Cyclin D1、P21、Bax、Bcl-2和GAPDH抗体室温孵育2 h，TBST洗膜10 min，漂洗3次，加入相应的二抗室温孵育1 h，TBST洗膜10 min，漂洗3次，利用化学发光试剂进行显影，拍照后，以GAPDH为内参照，图像处理软件分析各目的条带的灰度值。

1.3 统计学分析 采用SPSS20.0软件进行统计学分析。所有实验分组均设置3个平行实验或复孔，实验重复3次。所有实验数据均采用±s表示。采用t检验进行组间比较，以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 哮喘过敏原作用于16HBE对细胞增殖、凋亡及炎症因子表达的影响 见图1、表1和表2，与对照组相比，尘螨抗原浸出物组16HBE在24、48、72 h细胞活力显著降低，细胞凋亡率显著升高，炎症因子TNF-α和TSLP的表达显著升高（P＜0.001）。

2.2 PCGEM1在尘螨抗原浸出物刺激的16HBE中的表达 与对照组（1.01±0.10）相比，尘螨抗原浸出物组（0.24±0.02）16HBE细胞PCGEM1的表达水平显著降低（t=22.651，P＜0.001）。

图1 尘螨抗原浸出物作用于16HBE对细胞凋亡的影响Fig.1 Effect of dust mite antigen extract on 16HBE on apoptosis

2.3 抑制PCGEM1对尘螨抗原浸出物作用于16HBE增殖的影响 与si-NC组相比，si-PCGEM1组16HBE中的PCGEM1表达显著降低，Cyclin D1表达水平显著降低，P21的表达水平显著升高，细胞在24、48、72 h细胞活力显著降低（P＜0.001，图2）。

2.4 抑制PCGEM1对尘螨抗原浸出物作用于16HBE中凋亡及炎症因子表达的影响 与si-NC组相比，si-PCGEM1组16HBE中Bax蛋白表达水平显著升高，Bcl-2蛋白表达水平显著降低，细胞凋亡率显著升高，细胞上清液中TNF-α和TSLP表达显著升高（P＜0.001）。见图3、表3。

表2 尘螨抗原浸出物作用于16HBE对细胞炎症因子表达的影响（±s，n=9）Tab.2 Effect of dust mite antigen extract on expression of cytokines in 16HBE（±s，n=9）

表2 尘螨抗原浸出物作用于16HBE对细胞炎症因子表达的影响（±s，n=9）Tab.2 Effect of dust mite antigen extract on expression of cytokines in 16HBE（±s，n=9）

Note：Compared with control group，1）P＜0.001.

GroupsTNF-α（pg/ml）TSLP（pg/ml）Control45.672±3.59427.182±2.685 Dust miteantigen extract144.582±12.5921）112.275±10.2721）t 22.66024.044 P 0.0000.000

图2 抑制PCGEM 1对尘螨抗原浸出物作用于16HBE增殖蛋白表达的影响Fig.2 Effect of PCGEM 1 inhibition on expression of 16HBE proliferative protein by dust mite antigen extract

表1 尘螨抗原浸出物作用于16HBE对细胞增殖、凋亡的影响（±s，n=9）Tab.1 Effect of dust mite antigen extract on 16HBE on cell proliferation and apoptosis（±s，n=9）

表1 尘螨抗原浸出物作用于16HBE对细胞增殖、凋亡的影响（±s，n=9）Tab.1 Effect of dust mite antigen extract on 16HBE on cell proliferation and apoptosis（±s，n=9）

Note：Compared with control group，1）P＜0.001.

Cell activity（490 nm）Apoptosis Groupsrate（%）24 h48 h72 h Control0.62±0.060.95±0.091.38±0.148.01±0.84 Dust mite antigen extract0.34±0.031）0.44±0.041）0.59±0.061）28.82±2.931）t 12.52215.53515.56020.482 P 0.0000.0000.0000.000

表3 抑制PCGEM 1对尘螨抗原浸出物作用的16HBE凋亡及炎症因子表达的影响（±s，n=9）Tab.3 Effect of inhibition of PCGEM 1 on apoptosis of 16HBE and expression of inflammatory factors in dust mite antigen extract（±s，n=9）

表3 抑制PCGEM 1对尘螨抗原浸出物作用的16HBE凋亡及炎症因子表达的影响（±s，n=9）Tab.3 Effect of inhibition of PCGEM 1 on apoptosis of 16HBE and expression of inflammatory factors in dust mite antigen extract（±s，n=9）

Note：Compared with si-NCgroup，1）P＜0.001.

GroupsTNF-α（pg/ml）TSLP（pg/ml）BaxBcl-2Apoptosisrate（%）si-NC140.286±13.591113.511±11.2510.42±0.040.71±0.0728.11±2.82 si-PCGEM1178.110±16.2241）139.160±12.4281）0.71±0.071）0.35±0.031）34.12±3.511）t 5.3614.59010.79114.1814.004 P 0.0000.0000.0000.0000.000

表4 过表达PCGEM1对尘螨抗原浸出物作用的16HBE凋亡及炎症因子表达的影响（±s，n=9）Tab.4 Effects of overexpressing PCGEM 1 on apoptosis of 16HBE and expression of inflammatory factors by dust mite an⁃tigen extract（±s，n=9）

表4 过表达PCGEM1对尘螨抗原浸出物作用的16HBE凋亡及炎症因子表达的影响（±s，n=9）Tab.4 Effects of overexpressing PCGEM 1 on apoptosis of 16HBE and expression of inflammatory factors by dust mite an⁃tigen extract（±s，n=9）

Note：Compared with pcDNA3.1 group，1）P＜0.001.

GroupsTNF-α（pg/ml）TSLP（pg/ml）BaxBcl-2Apoptosis rate（%）pcDNA3.1142.275±13.599113.046±12.0460.43±0.040.74±0.0728.43±2.85 pcDNA3.1-PCGEM159.671±6.1241）36.511±3.6141）0.09±0.011）1.07±0.111）12.24±1.321）t 16.61618.25724.7397.59316.759 P 0.0000.0000.0000.0000.000

图3 抑制PCGEM 1对尘螨抗原浸出物作用于16HBE凋亡及凋亡蛋白表达的影响Fig.3 Effect of PCGEM 1 inhibition on apoptosis and apoptosis protein expression of 16HBE by dust mite antigen extract

2.5 过表达PCGEM1对尘螨抗原浸出物作用于16HBE增殖的影响 与pcDNA3.1组相比，pcD‐NA3.1-PCGEM1组16HBE中的PCGEM1表达显著升高，Cyclin D1表达水平显著升高，P21表达水平显著降低，细胞在24、48、72 h细胞活力显著升高（P＜0.001，图4）。

2.6 过表达PCGEM1对尘螨抗原浸出物作用的16HBE凋亡及炎症因子表达的影响 与pcDNA3.1组相比，pcDNA3.1-PCGEM1组16HBE中Bax蛋白表达水平显著降低，Bcl-2蛋白表达水平显著升高，细胞凋亡率显著降低，细胞上清液中TNF-α和TSLP表达显著降低，（P＜0.001，图5、表4）。

图4 过表达PCGEM 1对尘螨抗原浸出物作用的16HBE增殖蛋白表达的影响Fig.4 Effect of overexpressing PCGEM 1 on expression of 16HBE proliferative protein in role of dust mite an⁃tigen extract

图5 过表达PCGEM1对尘螨抗原浸出物作用的16HBE凋亡及凋亡蛋白表达的影响Fig.5 Effects of overexpressing PCGEM 1 on apoptosis and expression of apoptotic proteins in 16HBE in⁃duced by dust mite antigen extract

3 讨论

lncRNA是一类长度超过200个核苷酸的蛋白质编码能力有限的RNA，其可在转录、转录后和表观遗传学调节等多个水平调控生物过程。近年来，lncRNA在哮喘患者中的作用被逐渐揭示。例如，哮喘大鼠模型生长抑制特异性转录本5（growth arrestspecific 5，GAS5）的表达上调，GAS5通过miR-10a促进气道平滑肌细胞增殖，敲除GAS5可显著降低哮喘大鼠的气道高反应性［8］；靶向人浆细胞瘤转化迁移 基 因1（plasmacytoma variant translocation 1，PVT1）可控制重症哮喘患者气道平滑肌细胞增殖和炎症因子释放，有效减少气道重塑，对哮喘患者具有积极意义［9］；外周血Treg和Th17细胞失衡的程度与哮喘症状的严重程度呈正相关，母系表达基因3（maternally expressed gene 3，MEG3）通过调控哮喘患者Treg/Th17平衡进而缓解哮喘症状［10］。PC‐GEM1最早发现于前列腺癌，其在前列腺癌中表达上调，抑制PCGEM1可抑制肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭，并诱导早期凋亡［11］。此外，PCGEM1在卵巢癌和子宫内膜癌中也发挥癌基因作用，参与肿瘤的发生发展［12-13］。但PCGEM1在支气管哮喘中的作用并未阐明。

本研究以过敏原刺激支气管上皮细胞，探讨PCGEM1对支气管上皮细胞增殖、凋亡及炎症反应的影响。气道上皮细胞是抵抗病原体的天然屏障，当其受到病原体或过敏原刺激后，支气管上皮细胞产生TSLP等炎症细胞因子，TSLP通过与其受体相互作用，激活局部树突细胞，促进Th2免疫应答炎症反应，进一步诱导支气管上皮细胞凋亡，破坏上皮屏障的完整性［14-15］。TNF-α是支气管哮喘研究中重要的检测指标，正常情况下可参与抗组织感染和炎症反应，但TNF-α的过度产生则促进炎症细胞聚集，加剧气管炎症反应［16］。本研究显示，尘螨抗原浸出物刺激后支气管上皮细胞活力显著降低，细胞凋亡率显著升高，炎症因子TNF-α和TSLP表达显著升高，PCGEM1表达水平显著降低。进一步研究发现抑制PCGEM1可促进TNF-α和TSLP分泌，促进P21和Bax蛋白表达，抑制Cyclin D1和Bcl-2蛋白表达，加剧尘螨抗原浸出物刺激对支气管上皮细胞的增殖抑制和凋亡促进作用；而过表达PCGEM1则逆转尘螨抗原浸出物刺激对支气管上皮细胞的增殖、凋亡及TNF-α和TSLP分泌的影响。提示PCGEM1在支气管哮喘进展中具有重要作用。然而，lncRNA调控通路复杂，PCGEM1下游是否存在miRNA/mRNA调控网络是下一步研究重点［3］。

综上所述，尘螨抗原浸出物刺激后支气管上皮细胞中PCGEM1表达水平显著下调，过表达PC‐GEM1可促进哮喘过敏原刺激条件下支气管上皮细胞增殖，减少细胞凋亡，减轻炎症，上调PCGEM1有望成为支气管哮喘治疗的新途径。