食源性致病菌快速检测方法研究进展

姚帮本，闫 超，姚 丽，陈赵然*，陈 伟*

(1.安徽省产品质量监督检验研究院 安徽 合肥 230051；2.合肥工业大学 食品科学与生物工程学院 安徽 合肥 230009)

“民以食为天，食以安为先”，食品安全关乎着人们“舌尖上的安全”，直接影响人民群众的身体健康和生命安全。食品安全问题是指生物和化学性等因素从原材料到成品各个环节对食品所带来的潜在影响和对人类健康造成的危害。影响因素主要包括食源性致病微生物、农兽药滥用、重金属、真菌毒素污染、非法添加、掺杂使假以及食品接触材料中的危害成分迁移等。食源性致病菌污染是导致食源性疾病的主要原因，美国每年都有约4 800万例食源性疾病患者(相当于六分之一的美国人)，约12.8万人住院和3 000人死亡[1]。目前常见的食源性致病菌主要有金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌、致病性大肠杆菌、致病性弧菌、弯曲杆菌、单核细胞增生李斯特菌、蜡样芽孢杆菌和阪崎肠杆菌等[2]。常规的检测方法主要有平板分离法、化学分析法和免疫分析法等。但这些方法都或多或少存在不足，如步骤繁琐、检测周期长、成本高、对操作人员的专业水平要求高。因此，开发简单、灵敏、快速和低成本的检测复杂食品样品中致病菌的方法成为迫切需求。

本文综述了以免疫分析、分子生物学、生物传感器、代谢学、核酸适配体为基础的快速检测食源性致病菌的方法，阐述了各方法的原理、优缺点和应用现状等，并讨论了现有快速检测方法存在的问题和未来的发展方向，以期为食源性致病菌快速检测技术的发展提供参考，对各学科研究和食品安全监管具有一定意义。

1 食源性致病菌快速检测方法

1.1 免疫学检测技术

1.1.1 酶联免疫吸附测定技术酶联免疫吸附测定[2-3](Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)技术是将抗原与抗体反应和酶化学反应结合到一起的测定技术，具有灵敏度高、快速、特异性强的特点，所需仪器化程度低，样本前处理相对简单，特别适于现场监控和大量样本筛查。

Zhai等[4]采用杂交瘤细胞技术制备了7株阪崎克罗诺杆菌单克隆抗体，用其中一株建立的间接竞争酶联免疫吸附测定法对阪崎克罗诺杆菌的检测灵敏度可达106CFU/mL。Feng等[5]利用双抗夹心ELISA法对大肠埃希氏菌O157∶H7进行了检测(示意图见图1)，结果表明，该方法在105～108CFU/mL范围内具有良好的线性关系，灵敏度达1×104CFU/mL。此外，经过8 h的增菌，该方法对人工污染的绿茶样品中大肠埃希氏菌O157∶H7的检测灵敏度达到0.4 CFU/g。

图1 双抗夹心ELISA法原理示意图Fig.1 Sandwich ELISA principle diagram

1.1.2 免疫层析技术免疫层析(Immuno chromatography，IC)技术的检测原理是将目标物的特异性抗体固定在硝酸纤维素膜上，然后目标物在毛细管层析的作用下从样品区向硝酸纤维素膜迁移，在经过固定有特异性抗体的区域时，抗原抗体发生特异性免疫识别反应，使目标物被固定在特定的区域，最后再通过肉眼、紫外或红外光激发、酶促反应显色等方法判定检测结果。该项技术操作方便，读取结果的时间最短的只需3～5 min，最长不超过30 min。高度特异的抗原抗体反应可保证该检测结果保持很高的特异性和灵敏度。一般只需不到100 μL样本即可得到检测结果。产品只需室温保存，有效期长，适用范围广，移植能力强，且非专业人员也可以操作。

Hassan等[6]首次使用单克隆抗体荧光横向流动免疫分析法检测了牛肉中的大肠杆菌O157∶H7，这种新方法的灵敏度是传统横向流动分析方法的数千倍，在牛肉中的检出限为178 CFU/g。此外，该方法的检测成本比传统方法低60%，且结果可采用智能手机读取。Liu等[7]建立了一种检测水产品和腹泻患者粪便中副溶血性弧菌的免疫层析方法，该方法对副溶血性弧菌有很高的特异性和敏感性，检出限为1.2×103CFU/mL，对32株目标菌、13个白虾和146个腹泻患者粪便样本的敏感性和特异性检测率均为100 %。Qi等[8]将免疫磁性纳米颗粒与免疫层析技术相结合，建立了一种快速、高灵敏检测大肠埃希氏菌O157∶H7的方法，灵敏度从105CFU/mL提高到103CFU/mL。吴颖等[9]开发了一种检测金黄色葡萄球菌的胶体金免疫层析试纸条方法，将一种金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)的单克隆抗体连接胶体金，通过另一株SPA的单克隆抗体包被硝酸纤维素膜，制备双抗夹心法胶体金免疫层析试纸条，灵敏度达1×106CFU/mL。Chen等[10]使用末端功能化的引物对目标基因进行扩增，开发了一种基于量子点的快速、高敏检测金黄色葡萄球菌的免疫层析试纸条方法，在奶粉和肉类样本中的检测限分别为3×100CFU/mL和3×101CFU/g。Noguera等[11]用碳纳米粒子标记中性抗生物素蛋白，利用双修饰的特异性引物进行扩增，建立了一种可以针对大肠杆菌不同基因的免疫层析试纸条检测方法，灵敏度达104～105CFU/mL。

1.1.3 免疫荧光技术免疫荧光技术(Immunofluorescence technique，IFT)通过将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体(或抗原)上，使之在与其相应的抗原(或抗体)结合后，于荧光显微镜下呈现特异性的荧光反应。目前普遍使用的荧光色素是免疫荧光微球和量子点。使用荧光色素标记的抗体作为特异性免疫荧光探针，通过与致病菌结合复合物的荧光强度变化可实现致病菌的定量检测[12]。

免疫荧光技术具有发射波长可控、光稳定性好、快速、灵敏度高等特点，还可与其他技术相结合进行食源性致病菌的检测。Xue等[13]将免疫磁性纳米粒子和免疫量子点相结合，对大肠杆菌O157∶H7进行定量检测，2 h内即能检测到低至14 CFU/mL的大肠杆菌O157∶H7。Mitchell等[14]应用量子点标记技术检测大肠杆菌O157∶H7，检测限为49×10-15mol/L。Hu等[15]采用量子点进行荧光标记检测金黄色葡萄球菌，检出限为103CFU/mL，该方法的样品不需进行预处理与增菌，可直接进行检测，整个检测时间约为3 h。此外，法国梅里埃公司的全自动免疫分析仪(VIDAS)的原理即是基于酶联荧光免疫分析技术：包被了固相抗体的固相吸附器捕获样品中目标菌的特异性抗原，随后碱性磷酸酶标记的二抗再与目标菌的特异性抗原结合，二抗连续的碱性磷酸酶将底物水解，产生的磷酸-4-甲基伞形酮在370 nm下能够产生荧光，将测定的荧光强度与设定阈值的大小进行比较，若高于阈值则判断结果为阳性，低于阈值则判断为阴性。王似锦等[16]采用全自动免疫分析仪对保健食品中沙门氏菌进行检测，检验时间可以缩短至48 h。

1.1.4 免疫磁分离技术免疫磁分离技术(Immunomagnetic beads separation techniques，IMBS)作为食品样品有效的预浓缩技术，能够快速地从复杂食品基质中选择性分离和浓缩靶细菌。其主要原理是超顺磁性颗粒表面经化学修饰后，与靶细菌特异性的活性蛋白质结合制成免疫磁珠(Immunomagnetic beads，IMBs)，然后IMBs上的抗体将会特异性识别与捕获待检样品中的目标菌,形成IMBs-目标菌复合物。最后依靠磁场的作用力快速地使复合物与样品中其他杂质分离，从而达到高效、精准浓缩目标微生物的目的。

免疫磁分离技术具有特异性强、灵敏度高、分离速度快的特点[17-18]，可与多种其他技术相结合达到快速检测食源性致病菌的效果。Chen等[19]采用免疫磁分离技术和PCR相结合的方法检测婴幼儿配方奶粉中的阪崎肠杆菌，检出限达52 CFU/mL，检测方法灵敏、快速。Zeng等[20]建立了一种免疫磁分离-环介导等温扩增(IMS-LAMP)技术检测牡蛎中副溶血性弧菌的快速方法，该方法特异性良好，经8 h前增菌后，最低检测限达到0.19 CFU/g，检测时间缩至24 h。寇晓晶等[21]将免疫磁分离技术和ATP发光技术联合用于沙门氏菌、单核细胞增生李斯特菌和金黄色葡萄球菌的快速检测，与传统的细菌培养方法有良好的线性相关性，检测限低至102CFU/mL。Huang等[22]将免疫磁分离技术与荧光纳米针横向流动相结合检测生乳中的大肠杆菌O157∶H7。使用免疫磁分离技术后，荧光纳米针横向流动试纸条的荧光信号值增强，说明免疫磁分离技术可富集大肠杆菌O157∶H7并减少食品基质的干扰。

免疫学检测技术是以酶标记的抗体(或抗原)为主要试剂，将抗原抗体反应的特异性和酶催化底物反应的高效性和专一性相结合的一种免疫方法，对标记用酶具有特定要求，如活性高、纯度高等;对相应的标记物也有特定要求，如荧光标记物需荧光效率高，与蛋白质结合稳定，易于保存等。免疫技术受灵敏度和精确度的限制，一般用来对大量样本进行初筛，最终精准定量需要借助仪器确认。

1.2 分子生物学检测技术

分子生物学是从分子水平研究生物大分子的结构与功能从而阐明生命现象本质的科学，其发展始于Crick和Watson[23]在1953年提出的双螺旋结构，标志着现代分子生物学的兴起。分子生物学技术具有高灵敏度和特异性，被广泛用于食源性致病菌的检测。常用的分子生物学检测方法有聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR)、多重PCR(mPCR)、实时定量荧光PCR(qPCR)、数字PCR和基因芯片等。

1.2.1 PCR技术PCR技术是最早发展起来的分子生物学检测技术，是以变性、退火、延伸为周期循环进行的体外DNA扩增的过程，可在短时间内使目标基因成倍增加，扩大检测对象的数量，从而提高检测灵敏度。

Rahn 等[24]在1992年第一次设计了一对沙门氏菌invA基因的引物来检测沙门氏菌，采用此方法检测了100多个血清型的630株沙门氏菌，对照组由21属细菌的142个非沙门氏菌菌株组成。结果仅有4株未检出，检出率为99.4 %。Pinto等[25]将PCR技术和ELISA技术相结合，对贝类中副溶血性弧菌的一个特异性基因进行扩增，使用生物素标记的寡核苷酸探针捕获地高辛(DIG)标记的PCR产物，用ELISA方法进行检测，灵敏度较普通PCR产物的琼脂糖凝胶电泳提高了100倍。PCR技术灵敏度高、特异性强，但易受污染，且无法对检测过程中出现的死亡菌株进行识别，因而可能出现假阳性条带。

PCR技术也是食源性致病菌快速检测的常用方法。但该方法的扩增结果不能肉眼直接识别，需要借助凝胶电泳等方法进行表征，在定量丰度低的不可培养微生物时的准确性不强。

1.2.2 多重PCR技术多重聚合酶链式反应(Multiplex polymerase chain reaction，mPCR)，是在传统PCR的基础上，在同一个PCR反应体系中加入多对特异性引物和模板(引物与相对应的模板特异性结合)同时扩增出多个不同序列的DNA片段。在同一反应体系中扩增多个DNA片段，可同时检测多种食源性致病菌，减少实验操作次数、缩短检测时间、节省试剂。

杨国兴等[26]选取金黄色葡萄球菌nuc基因、沙门氏菌SipB基因、志贺氏菌ipaH基因和单增李斯特菌inlA基因作为目标基因，设计了4对PCR引物，建立并优化了多重PCR反应体系，评价了该体系的特异性和灵敏度，并对人工污染的熟肉样品进行检测。结果显示构建的多重PCR方法特异性强、灵敏度高，人工污染熟肉匀浆中4种致病菌的检出限为103CFU/mL。熊苏玥等[27]选取金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因(nuc)、沙门氏菌的正转录调节蛋白基因(hilA)、大肠杆菌O157∶H7鞭毛基因(flic)、单核细胞增生李斯特氏菌的毒力调控蛋白基因(prfA)及霉菌18S rRNA基因V5区，分别设计了5对特异性引物，并对PCR扩增反应体系和扩增条件进行优化，确定获得特异性良好的PCR扩增产物。随后在37 ℃下对人工污染致病菌的香肠、面包和豆腐进行增菌培养，5种致病微生物在20 h内的检出限均可达到10 CFU/25 g。Yang等[28]将多重PCR与膜芯片技术联用，可同时检测非预包装即食食品中9种食源性致病菌，综合检出限达0.01 ng核酸样本。

多重PCR技术适合检测症状相同或易污染相同食品的多种食源性致病菌，可使食品中微生物的检测实现标准化。由于多对引物在同一体系中进行扩增，各对引物之间相互影响，因此多重PCR实际操作过程中的扩增效果和实际扩增的片段数目往往不尽如人意。

1.2.3 实时荧光定量PCR技术实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR，qPCR)是在PCR体系中加入荧光标记的探针或荧光物质，并通过仪器实时监测整个PCR扩增过程中荧光信号的积累，最后通过标准曲线对未知浓度的样品进行定量分析的方法。

Nadin-Davis等[29]采用qPCR方法，以6个靶基因快速检测肠道沙门氏菌，对239个家禽设施中的样本进行测定，结果表明qPCR和普通培养方法在结果上呈现出良好的一致性，且qPCR方法比普通培养方法更省时。目前市面上有一种新型干燥型荧光PCR检测试剂盒[30]，可对副溶血性弧菌、大肠埃希氏菌O157∶H7和单增李斯特菌进行检测，该试剂盒干燥后不影响酶的活性，可常温运输保存、运输，对上述3种食源性致病菌的检测灵敏度分别为140、380、7 900 CFU/mL，与常见品牌试剂盒效果相当。此外，Alia等[31]开发了一种独特的四重实时定量荧光PCR方法，该方法能够区分加工肉制品和即食肉制品中4种血清型的单核细胞增生李斯特菌，具有高灵敏度、高特异性和快速的特点，对于识别肉制品加工过程中单核细胞增生李斯特菌的污染来源和即食肉制品中持久性菌株的流行病学监测很有意义。张焱鑫等[32]用实时荧光PCR法和国标法对采集的60件畜产品、水产品和乳及乳制品中的沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌、副溶血性弧菌进行同时检测。结果表明，除金黄色葡萄球菌检测结果均为阴性外，其他3种致病菌2种方法均有检出，但实时荧光PCR法的阳性率均高于国标法。

qPCR是一项融合了多种技术的检测手段，与普通PCR相比,qPCR技术的核酸扩增在封闭系统中完成，扩增完成后不需进行电泳分析，不仅减少了样品的污染机会，也避免了污染造成的假阳性结果，缩短了检测时间。具备重复性好、快速、实时性强、灵敏度高、可定量检测的特点，现已成为食源性致病菌检测的研究热点。但实时荧光定量PCR技术实验成本较高，所需仪器昂贵，需要操作人员具有较高的专业技术水平。

1.2.4 数字PCR技术数字PCR(Digital PCR，dPCR)技术是将qPCR体系等量均分到相互隔离的大数量(多数大于10 000个)微小的反应单元(芯片微孔或微滴液珠)中，且理想状态下一个反应体系中至多包含一个待测核酸分子。dPCR的反应过程与qPCR相似，扩增后的核酸分子在荧光下显示荧光信号(表示为“1”)，或没有荧光信号(表示为“0”)，通过泊松分布对荧光信号“0”和“1”进行统计分析，即可实现对核酸含量的测定。dPCR不需要建立标准曲线，无需通过Ct值(PCR荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数)进行浓度比较，被认为是一种绝对定量的方法[33-35]。数字PCR原理示意图见图2。微滴式数字PCR((Droplet digital PCR，ddPCR)是一种将单个目标DNA分子分散到多个分离的液滴中，经PCR扩增后，逐个对每个微液滴进行检测，精确定量DNA拷贝数的新方法。在ddPCR检测中，目标DNA分子的分布服从泊松统计，这意味着大多数反应要么包含一个目标，要么不包含目标。理想情况下，ddPCR阳性反应的数量等于最初存在的模板DNA分子的数量[36]。

图2 数字PCR原理示意图Fig.2 Principle diagram of digital PCR

马薇等[37]以大肠菌群的lacZ基因为靶基因，建立了一种快速、稳定、灵敏、特异的ddPCR定量检测方法，可检出每μL单个拷贝数的大肠菌群lacZ基因组DNA。方佩佩等[38]用微滴式数字PCR技术建立了副溶血性弧菌的快速定量检测方法。结果表明，该法检测特异性好，副溶血性弧菌有效基因组DNA浓度范围为2～19 440拷贝/20 μL，分析得菌悬液浓度为50～4.86×105CFU/mL，与3M测试片所得菌悬液浓度无显著性差异；与荧光PCR相比，ddPCR可以进行更低浓度检测且能准确定量。Li等[39]采用一种ddPCR方法对苹果汁、牛奶和菠菜洗液中的大肠埃希氏菌O157∶H7和O104∶H4进行定量检测，在苹果汁中的检出限达2 CFU/mL。邓雪蕾等[40]设计制作了一种基于聚二甲基硅氧烷-玻璃的多功能集成式ddPCR芯片，对副溶血性弧菌基因组DNA进行绝对定量，定量的线性范围跨越5个数量级，检测结果与理论参考浓度间具有良好的相关性。

数字PCR技术具有高灵敏度、高精确度、高耐受性和绝对定量的优点，已在稀有突变检测和复杂样本基因表达检测等方面得到广泛的应用。

1.2.5 基因芯片技术基因芯片(Gene chip，GC)是一种新型的分子生物学检测技术。GC通过采用原位合成或显微点样技术将大量DNA探针有规律地固化于玻璃芯片或硅芯片载体上，然后与待测标记样品按碱基配对原理杂交，经放射自显影、激光共聚焦荧光检测系统等扫描芯片，对杂交信号进行检测分析，获得样品的基因序列、基因表达等遗传信息[41-42]。

近年来，采用基因芯片技术对食源性致病菌进行检测的研究逐渐增多，Suo等[43]利用基因芯片与多重PCR相结合的技术检测了大肠杆菌O157∶H7、沙门氏菌的3个种、空肠弯杆菌以及单核细胞增生李斯特菌。Day等[44]利用悬浮芯片系统对单核细胞增生李斯特菌进行检测，使用磁性微球-抗体偶联物对单核细胞增生李斯特菌上存在的特异性膜蛋白进行识别，可在24 h内识别哈密瓜和包装沙拉中的单核细胞增生李斯特菌，最低检出限达到100CFU/g。基因芯片技术的自动化程度高，可一次分析大量样品，数据客观可靠。但成本昂贵、检测灵敏度较低、重复性差，分析泛围较狭窄。

1.2.6 环介导等温核酸扩增技术环介导等温核酸扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是针对靶基因的6个区域设计4条特异性引物,并利用一种链置换DNA聚合酶在恒温条件(65 ℃左右)保温几十分钟，即可完成核酸扩增反应，具有高特异性和等温快速扩增的特点。

LAMP技术是Notomi等[45]于2000年开发的一种灵敏度高、检测时间短的核酸扩增方法。近年来越来越多被应用于食源性致病菌检测。关玉婷等[46]根据沙门氏菌特异性靶基因肠毒素stn基因设计了4条LAMP引物，建立的LAMP方法仅需30 min即可得到准确结果，可视化LAMP方法对3株沙门氏菌和8株非沙门氏菌表现出良好的检测特异性。杜琳等[47]针对金黄色葡萄球菌的TRAP基因设计LAMP引物，建立了金黄色葡萄球菌的LAMP测定方法，与生鲜乳中常见的大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、无乳链球菌、粪肠球菌无交叉反应，灵敏度为10 CFU/mL。Babu等[48]采用LAMP技术对致病性弯曲杆菌进行快速检测，样本包括纯培养物和阳性污染的即食食品，最低检出限达6 CFU每反应。Garrido-Maestu等[49-50]建立了基于环介导等温扩增技术检测不同类型食物中单核细胞增生李斯特菌的方法，检出限可低于10 CFU/25 g。Xu等[51]针对不同乳制品中的常见食源性致病菌，基于LAMP建立了便捷、快速、高效的检测方法，整个扩增过程可在30 min内完成，最低检出限可到1拷贝。

LAMP是一种实用价值及检测效率很高的等温扩增技术,同时也存在着明显的缺点：如加入环引物后，可能出现假阳性结果；虽然可借助各种方式减少假阳性发生的频率，但依旧无法避免其对引物设计要求高、难度大的缺陷；LAMP不适用于扩增较长片段，因为其产物不均匀，扩增产物组成复杂，多种长度片段共存的产物起不到再次验证扩增特异性的作用，且在反应体系中容易被污染[52]。

1.3 生物传感器检测技术

生物传感器(Biosensor)是一种对生物物质敏感并可将其浓度转换为电信号进行检测的仪器，是以固定化的生物敏感材料作识别元件(包括酶、抗体、抗原、微生物、细胞、组织、核酸等生物活性物质)，由适当的理化换能器(如氧电极、光敏管、场效应管、压电晶体等)及信号放大装置构成的分析工具或系统。根据工作原理不同，生物传感器可以分为：光学生物传感器、电化学生物传感器、酶生物传感器、物理生物传感器、机械生物传感器等。生物传感器检测技术由于高灵敏度、高特异性的特点，被广泛用于食源性致病菌的检测。下面主要介绍使用较多的光学生物传感器和电化学生物传感器。

1.3.1 光学生物传感器光学生物传感器(Optical biosensors)检测技术凭借检测快速和灵敏度高的特性被广泛应用于食源性致病菌检测。光学传感器可通过折射率的原位检测或通过细菌细胞附着在传感器表面受体上的厚度来区分食品中的微生物。光学传感器还包括一种可生物降解的聚合物，由微生物在天然产物代谢过程中产生的酶组成。目前主要的光学传感技术有比色、荧光、化学发光和表面等离子共振等。

Shang等[53]开发了一种基于化学发光的光学生物传感器检测食品中的单核细胞增生李斯特菌，在优化条件下，对牛奶中单核细胞增生李斯特菌的检测时间仅为40 min，最低检测浓度达到1.1 logCFU/mL。Kim等[54]发明了一种可视化的比色生物传感器来检测婴幼儿乳粉中的阪崎肠杆菌，在最优条件下，30 min内能直观检测到的最低浓度为7.1×103CFU/mL。Mudgal等[55]用BaTiO3-石墨烯-亲和层表面等离子体共振(Surface plasmon resonance，SPR)检测假单胞菌，检测时间为25 min，检出限为7.09 logCFU/mL。

1.3.2 电化学生物传感器电化学生物传感器(Electrochemical biosensor)通常将抗体、酶、适体、多肽等生物敏感物质或细胞器、细胞、组织等生物组分作为识别元件，电极作为转换元件。将生物识别元件通过生物固定化技术固定在电极上后，生物分子间特异性识别产生的各种物理、化学等信号将由电极转换成电阻、电位、电流或电容等物理量形式并作为特征检测信号输出，从而实现被测物的检测[56]。根据固定在电极表面的生物识别元件不同，电化学生物传感器可分为电化学酶传感器、电化学免疫传感器、电化学DNA传感器、电化学适体传感器、电化学多肽传感器等[57]。

Saini等[58]利用特异性的NH2标记探针建立了一种基于DNA的纳米传感器，用于检测牛奶样品中肠炎沙门氏菌的stn基因。采用循环伏安法(CV)和微分脉冲伏安法(DPV)进行电化学表征，DPV检测灵敏度为728.42 (μA/cm2)/ng，检测下限为1.8 pg/6 μL (0.3 pg/mL)。Sobhan等[59]用多克隆抗体成功固定了一种单壁碳纳米管生物传感器，在泡菜中检测小肠结肠炎耶尔森氏菌，最低检出限达104CFU/mL。Silva等[60]开发了一种在苹果汁中检测伤寒沙门氏菌的方法，该方法使金纳米粒子聚合物与包裹膜上的电位生物传感器结合，最低检出限达6 CFU/mL。Ge等[61]建立了一种简便的鼠伤寒沙门氏菌电化学检测传感器，灵敏度达16 CFU/mL，线性范围为20～2×108CFU/mL，具有良好的信号放大性能，重复性好，基质效应低。

1.4 代谢学检测技术

代谢学检测技术是食源性致病菌检测的一种常用技术手段。其原理是利用各种技术检测不同致病菌在特定培养环境下产生的初级代谢产物或次级代谢产物的量和种类的变化特征以对该致病菌进行鉴定。按照检测技术不同，分为电阻抗技术、三磷酸腺苷(ATP)生物发光技术、放射测量技术和微热量计技术等。下面对使用较多的电阻抗技术和ATP生物发光技术进行介绍。

1.4.1 电阻抗技术电阻抗技术依据微生物在生长过程中代谢活动的不同，通过电阻抗技术对微生物进行检测鉴定。Dong等[62]改进了电阻抗检测技术，使用金纳米颗粒和聚胺多壁碳纳米管-壳聚糖纳米复合膜修饰玻碳电极(AuNPs/PAMAM-MWCNT-Chi/GCE)来检测牛奶中的沙门氏菌，与仅用六氰化铁氧化还原电极的阻抗检测法相比，灵敏度提高至5.0×102CFU/mL。Tan等[63]在用聚二甲基硅氧烷(PDMS)阻抗免疫生物传感器检测金黄色葡萄球菌时，选取多孔氧化铝膜固定抗体，检测灵敏度为102CFU/mL。Dweik等[64]证实，采用阻抗免疫生物传感器检测大肠杆菌O157∶H7时，其抗原抗体结合率与反应时间之间不存在明显的线性关系，反应60 min后，抗原抗体结合率最高。Chowdhury等[65]使用阻抗免疫生物传感器检测大肠杆菌O157∶H7，选取聚苯胺(PANI)作为工作电极，检测线性范围为102～107CFU/mL。

1.4.2 ATP生物发光技术ATP生物发光技术利用活菌内含有ATP，当细菌死亡后其内的ATP被细胞内酶分解，应用荧光素和荧光素酶可使之释放能量并产生荧光，且荧光量与ATP浓度成正比的原理进行检测。因此，通过测定ATP浓度即可推算出活菌总数[66-67]。Chang等[68]在最佳的ATP再生条件下偶联生物发光法，对ATP标准品、大肠杆菌、铜绿假单胞菌的检测限分别为10-17mol/mL、102CFU/mL和102CFU/mL。该方法无需对样本中的微生物进行培养，操作简便、快捷且测定范围广，由于检测的是食品中的活菌总数，更能准确反映食品卫生的真实情况。其不足之处在于：易受温度、酸碱等因素影响，食品和ATP提取剂含有的某些离子会干扰测定；不能进行细菌鉴定；灵敏度有待提高；仅适用于细菌含量高的物质。该方法无特异性，但可通过用免疫磁分离技术(IMS)捕获靶细菌再进行荧光测定进行克服[69]。

1.5 核酸适配体检测技术

核酸适配体(Aptamer)是从包含随机序列的巨大核酸分子库中筛选出来的一种单链DNA或RNA配体，是一段能特异性识别并结合靶分子的15～90个碱基寡核苷酸片段。这些特异性选择的核酸序列可以结合广泛的非核酸靶点，并且具有高亲和力和高特异性。同时，所选已知序列的适配体可批量制备，易于官能团修饰，与生物分子或荧光标记结合的稳定性好。适配体的这些独特特性[70]，为快速高效的食源性致病菌现场即时检测提供了巨大的发展潜力。

适配体的选择过程称为指数富集配体系统进化(SELEX)，由两个独立的研究小组于 1990 年开发[71-72]。SELEX 是适配体选择的一个重要工具，为适配体和基于适配体技术的发展奠定了基础。SELEX 过程包含多个循环，每个循环包含4个步骤：(1)将寡核苷酸库与目标物孵育；(2)将与目标物结合和未结合的核酸序列分离，并删除未与目标物结合的序列；(3)将与目标物结合的序列用洗脱缓冲液洗脱下来；(4)将洗脱下来的序列作为后续聚合酶链反应(PCR)的模板，进行 PCR 扩增。PCR 产物作为下一轮筛选的寡核苷酸库，按上述步骤进行多达20轮的筛选，直到获得具有高靶亲和力的适配体序列库[73]，这些适配体可以被克隆并测序。一般来说，一个随机的寡核苷酸库包含 40～100个单链核苷酸序列，每个序列的中间部分为随机序列的核苷酸，两端为固定序列。

SELEX 技术已被应用于筛选致病菌的适配体。目前已有较多的常见致病菌筛选出核酸适配体，比如大肠杆菌[74]、副溶血弧菌[75]、鼠伤寒沙门氏菌[76]、单增李斯特菌[77]。与传统的抗体生成过程相比，SELEX可以在相对较短的时间内有效地生成针对各种分析物的特异性核酸探针。更重要的是，所选择的适配体的特殊性质，如易于规模合成、易于修饰和长期稳定性等，使适配体成为传统抗体的理想替代品。

1.5.1 纳米金适配体技术纳米金适配体技术是核酸适配体与纳米金技术结合，构建的高灵敏度、高特异性的快速检测技术。当目标菌存在时，适配体作为识别与捕获因子特异性地结合目标菌，并引起纳米金状态发生改变。基于状态变化，可对目标菌进行定性与定量分析。

Jia等[78]将铜绿假单胞菌的适配体与超顺磁性氧化铁纳米粒子共价结合，通过在加入目标菌后测量自旋-自旋弛豫间(T2)的增加对靶物质进行定量测定。该法已应用于鸡肉与饮用水样品中铜绿假单胞菌的检测，检测可在40 min内完成，检测限为50 CFU/mL。Chen等[79]利用双适配体修饰的牛血清蛋白可稳定金纳米团簇并增强细菌对过氧化物酶类的活性，开发了一种快速检测沙门氏菌的方法，最低检出限达1 CFU/mL。Li等[80]提出了一种新的表面增强拉曼散射响应方法，该法基于适配体、互补DNA、对氨基噻吩(PATP)和金纳米棒对食源性致病菌进行检测。在最优条件下，表面增强拉曼散射信号与鼠伤寒沙门氏菌浓度在56～56×107CFU/mL范围内线性相关，检出限为9 CFU/mL。

1.5.2 荧光适配体技术荧光适配体技术是将核酸适配体与荧光标记技术结合，基于适配体与相应食源性致病菌作用后发生的荧光强度变化检测食源性致病菌。利用荧光基团或猝灭基团修饰适配体，加入目标菌后，适配体构象发生的改变可引起荧光信号的变化。

Jiang等[81]基于金属有机骨架材料的荧光猝灭特性以及对核酸适配体的吸附性，结合核酸适配体的高亲和力与高特异性识别能力，构建了特异性识别沙门氏菌的新方法，荧光信号与沙门氏菌浓度的对数在101～105CFU/mL范围内呈良好的线性关系，检出限为7 CFU/mL。Maeng等[82]根据RNA适配体荧光强度的变化，开发了金黄色葡萄球菌等致病菌的检测系统，将筛选出的RNA适配体通过硫醇基团固定在银膜上，RNA适配体捕获的细菌可通过添加适配体和携带有荧光素基团的胸腺嘧啶脱氧核苷酸(dT-FAM)的复合物后导致的荧光发射量的增加而被检测。该方法操作简捷、快速、特异性强。Huang等[83]通过磁选技术的12轮筛选，在体外获得了亲和度高、选择性好的可与金黄色葡萄球菌肠毒素A结合的核酸适配体，用于食品样品中金黄色葡萄球菌的肠毒素A的检测，检出限为8.7×10-3μg/mL。

1.5.3 电化学适配体技术电化学适配体技术通过将核酸适配体与电化学技术结合，使适配体与电化学活性传感元件固定在电极上。有目标菌存在时，适配体与目标菌结合导致电极表面修饰物结构改变，可通过检测电化学信号或电流变化进行定性与定量检测。

Luo等[84]建立了检测大肠杆菌O111的电化学适配体生物传感器技术，先将捕获探针通过Au-硫醇锚定在电极表面上，适配体因与捕获探针杂交被固定在金电极表面，当目标菌存在时，适配体会识别、结合目标菌并脱离捕获探针，捕获探针与标记生物素的检测探针结合后留在电极表面，并在加入识别元件链霉抗碱性磷酸酶后产生电化学信号。该技术可在3.5 h内实现对目标致病菌的精确定量，对牛奶样品中目标菌的检测限为305 CFU/mL，是一种特异性强、准确性高、灵敏、快速的检测技术。Abbaspour等[85]设计了一种基于双适配体的电化学夹心传感器测定法检测金黄色葡萄球菌，该方法通过固定在磁珠表面上的初级适配体捕获金黄色葡萄球菌，而与银纳米颗粒缀合的次级适配体可提供限定的电化学特性，显著提高了检测灵敏度，应用释放的Ag+离子进行差示脉冲阳极溶出伏安(DPV)信号的测量，实现了金黄色葡萄球菌的定性与定量检测。该方法灵敏度高，为采用适配体常规检测方法无法检测的微量细菌的检测提供了新方法。

2 食源性致病菌快速检测方法存在的问题及展望

近年来，多学科和各种技术的交汇发展、食品检验体量的增加、各种会议保障的需求等因素，促进了食源性致病菌快速检测方法的开发。但是各种食源性致病菌快速检测方法各有优缺点：免疫学方法成本低、操作简单，但灵敏度有待提高，且易出现假阳性；分子生物学技术虽然快速高效，但存在价格昂贵，基因测序还不完全等不足；代谢学检测技术具有快速、简便的优点，但需要大量的数据支撑，易受环境因素的影响；生物传感器和核酸适配体技术具有较强的特异性和选择性。总的来说，食源性致病菌快速检测方法具有特异性高、灵敏度高、成本低，对操作人员及环境和仪器要求低，检测速度快等优点，适合大量样品的快速筛查，能将食品安全问题遏制在进入消费者餐桌的前端，是保障食品安全和防控食源性致病菌感染的重要技术支撑。

各种技术的改进和创新提高了快速检测技术的准确性，解决了部分专业局限性的问题，为食源性致病菌快速检测技术的发展和应用提供了机遇。如分子生物学技术的飞速发展带来的高通量及绝对定量的检测分析技术，以蛋白质组学为基础的飞行时间质谱技术的发展和应用及胶体金技术与多学科的结合等，这些技术虽然还存在各方面的不足，需要进一步的改进和拓展，但在未来，随着生物传感器技术、核酸适配体技术、免疫学技术等各种检测技术的不断发展，食源性致病菌快速检测技术的准确度和灵敏度将逐步提高，检测成本将逐步降低，并最终应用于日常检测监管中，不断提高人们的食品安全等级。