通过式固相萃取/UPLC-MS/MS测定小麦粉及其添加剂中非食用物质三聚硫氰酸三钠盐

张艳侠，尹丽丽，薛 霞，徐向军，赵慧男，王 骏， 张 卉，刘艳明*，祝建华*

(1.山东省食品药品检验研究院 山东省特殊医学用途配方食品质量控制工程技术研究中心 山东省食品 药品安全检测工程技术研究中心，山东 济南 250101；2.中国石化天然气分公司 榆济管道公司， 山东 济南 250101)

三聚硫氰酸三钠盐(TMT)为一种重金属离子处理剂，通过钠离子与重金属离子的交换而形成稳定的化合物沉淀出来，达到去除重金属离子的目的[1-2]。因其对传统碱中和方法不能去除的重金属离子具有很好的去除效果而得到广泛应用[3-5]。TMT化学名为1,3,5-三嗪-2,4,6(1H,3H,5H)-三硫醇三钠盐，极易溶于水，其酸的形式为三聚硫氰酸(Trithiocyanuric acid,H3TMT)，水溶性差，主要用途为丙烯酸酯橡胶专用硫化剂及铜矿的浮选药剂等[6-8]。三聚硫氰酸及其钠盐均为化工用品，属于非食用物质，对水系统易产生危害，不允许大量接触地下水或城市用水系统。随着工业废水的大量排放，重金属污染的日益加剧，TMT在含重金属废水处理中的广泛应用带来了严重安全隐患[9-11]。作为大宗消费品，小麦及其制品的质量安全风险主要来源有本底污染、生物污染、化学污染、加工工艺的影响及违规使用添加剂或非法添加等[12-14]。近期有稽查机构查处了部分违禁小麦粉，其中含有非食用物质TMT，因此亟需加强小麦粉及其相关产品中TMT的监测。

TMT的研究主要集中在重金属污水处理方面，缺乏检测方法研究。对于小麦粉及其添加剂中TMT的检测方法未见报道且无相关检测标准。有文献分别利用酸碱滴定法和紫外分光光度法检测燃煤电厂脱硫废水中TMT含量[15]，该方法定性定量差，为常量检测。也有利用高效液相色谱法检测橡胶助剂H3TMT的报道，但该方法只针对标准品进行分析，不涉及前处理[16]。TMT与H3TMT互为共轭酸碱，H3TMT为三元酸，有3个离解常数，在水中可电离产生H3TMT、H2TMT-、HTMT2-和TMT3-4种形式[17]，因此有效地提取和测定TMT总含量是关键。基质方面，小麦粉添加剂包括玉米淀粉、各种盐、酶制剂等成分，分为盐式处理剂(FTA1)和酶式处理剂(FTA2)[18-20]。其中前者主要含有各种矿物质盐和维生素C等营养元素，水溶性好；后者以食用玉米淀粉、淀粉酶等复合酶为主，基质较复杂，遇水易成胶状，提取难度大。小麦粉及其添加剂常用的净化技术有固相萃取法、基质固相萃取法及免疫亲和柱法等[21-25]，前两者的净化能力不足且操作复杂，免疫亲和柱的适用范围小。Oasis PRiME HLB为通过型固相萃取柱，能有效去除磷脂、蛋白、油脂、色素及盐等杂质，已被用于肉及肉制品、水产品、禽副产品等中兽药残留的检测[26-29]。

本研究建立了小麦粉及其添加剂中三聚硫氰酸三钠盐总量的超高效液相色谱-串联质谱检测方法。优化的乙腈-甲酸/甲酸铵缓冲溶液提取体系不仅能有效提取TMT的各种形式，还能很好地分散各种类型的面粉添加剂；通过式Oasis PRiME HLB固相萃取柱无需活化和洗脱步骤，操作简单，可有效去除干扰，降低基质效应。该方法简便快捷，灵敏度高，重现性好，检测效率高，适用于小麦粉及其添加剂中三聚硫氰酸三钠盐总量的定性、定量检测。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

Agilent 1290 Infinity Ⅱ液相色谱和Agilent 6470三重四极杆液质联用系统，配喷射流电喷雾(Jet ESI)电离源，使用Agilent MassHunter采集软件(B.08.00版)和Agilent MassHunter定量分析软件(B.07.00 版)进行数据采集和分析(美国Agilent公司)。Sigma 3-18K高速冷冻离心机(德国Sigma公司)；超声波清洗器(宁波新芝生物科技有限公司)；MS3涡旋混合器(IKA公司)，N-EVAP-45位氮吹仪(美国Organomation公司)；SQP-电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司)；Milli-Q超纯水仪。

实测样品来自市场购买及稽查样品。三聚硫氰酸三钠盐标准品(纯度≥98.3%,阿尔塔公司)，避光保存；甲醇、乙腈(色谱纯，德国默克公司)；甲酸(FA)、甲酸铵(NH4FA)、醋酸铵(色谱纯，美国Sigma-Aldrich公司)；实验用水为超纯水；氮气(>99.999%)；固相萃取柱：Oasis PRiME HLB(200 mg/6 mL)，有机微孔滤膜(0.22 μm,上海安谱科学仪器有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液的配制准确称取10 mg(精确至0.01 mg)TMT标准品，用甲醇溶解后定容于10 mL棕色容量瓶中，配成质量浓度为1 mg/mL的标准储备液。用初始流动相将标准储备液稀释至适当浓度，得到标准工作溶液。上述溶液均于0～4 ℃避光保存。

1.2.2 样品前处理提取：称取均匀样品1 g(精确至0.000 1 g)于50 mL聚丙烯具塞离心管中，加入20 mL乙腈-100 mmol/L甲酸/甲酸铵缓冲溶液(pH 2.5,体积比8∶2)，涡旋1 min，超声15 min，8 000 r/min离心5 min，待净化。

净化：准确取5 mL提取液上Oasis PRiME HLB固相萃取柱，加1 mL乙腈淋洗，合并流出液，加水转移定容至25.00 mL，涡旋混匀离心，过0.22 μm微孔滤膜后，待测定。

1.2.3 基质效应取空白样品，按“1.2.2”制备空白基质溶液。分别用空白基质溶液和乙腈-10 mmol/L甲酸/甲酸铵溶液(pH 3.0,1∶9)稀释标准储备液，得到同浓度水平的测定液。分别测定样品空白基质溶液与纯溶剂中添加相同浓度目标成分的响应值，通过计算二者的相对比值评价基质效应(Matrix effect,ME)：ME(%)=(基质匹配标准溶液响应/无基质标准溶液响应-1)×100。

1.2.4 液相色谱条件色谱柱：Waters HSS T3(100 mm×2.1 mm,1.8 μm)；流动相：甲醇(A)和10 mmol/L甲酸/甲酸铵缓冲溶液(pH 3.0，B)。梯度洗脱程序：0～3.0 min，2%A；3.0～5.0 min，2%～20%A；5.0～6.0 min，20%～95%A；6.0～8.0 min，95%A；8.0～8.1 min，95%～2%A；8.1～10.0 min，2%A。流速：0.3 mL/min；柱温：25 ℃；进样体积：2 μL。

1.2.5 质谱条件离子源:喷射流电喷雾离子源(Jet ESI)；离子化模式：负离子模式(ESI-)；毛细管电压:3.0 kV;喷嘴电压:0 V;干燥气温度：250 ℃;干燥气流速:5 L/min;雾化气压力：0.31 MPa;鞘气温度：350 ℃;鞘气流速:11 L/min;扫描方式：多反应监测(MRM)；TMT的母离子为m/z175.8;碎裂电压为90 V;定性离子对为175.8>116.8，碰撞能量(CE)为10 eV；定量离子对为175.8>58.1，碰撞能量为40 eV。

1.3 数据处理

通过与仪器配套的MassHunter色谱数据处理系统完成数据采集与处理，采用Origin 8.0进行绘图。

2 结果与讨论

2.1 仪器条件的优化

2.1.1 质谱条件的优化TMT为带有3个巯基的三嗪类化合物，在ESI源下易电离形成负离子。将1 μg/mL的TMT标准溶液通过蠕动泵注入质谱仪，通过一级质谱扫描获得相应的母离子，并优化获得最优离子源参数。

TMT存在酮式和醇式两种同分异构体，二级全扫描结果显示在负离子模式下，TMT主要以丢失1个质子[M-H]-离子形式存在，且该碎片较稳定不易碎裂。优化碰撞能发现，当CE低于5 eV时主要以[M-H]-准分子离子峰存在；当CE达到10 eV时，出现m/z58.1和m/z116.8碎片，推测在此能量下杂环开始断裂，破坏稳定的环状结构不是其最优势反应；当CE达到40 eV时，整个环状结构均裂得到丰度较高的m/z58.1碎片。m/z58.1为不同断裂的叠加，响应较高且稳定，因此选择m/z58.1为定量离子，m/z116.8为定性离子。进一步优化碎裂电压、碰撞能量等参数，得到目标化合物的MRM质谱参数，具体见“1.2.5”。

图1 TMT的不同存在形式及反应Fig.1 The different forms and reactions of TMT

考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-10 mmol/L甲酸/醋酸铵溶液(pH 3.0)、甲醇-10 mmol/L甲酸/甲酸铵溶液(pH 3.0)几种流动相对目标物的分离效果。发现质子性溶剂甲醇较乙腈有更好的响应；甲醇-水不利于分子状态TMT的形成；相同pH值条件下，甲酸铵缓冲溶液较醋酸铵缓冲溶液有更好的响应和峰形。此外，不同pH值的流动相对TMT的色谱行为影响较大，比较了pH值为2.5、3.0、4.0、5.0、6.0的甲醇-10 mmol/L甲酸/甲酸铵溶液作为流动相对目标物的分离效果。结果发现，随着pH值的降低，色谱保留性能提高，在pH 3.0下TMT主要以H3TMT分子形式存在。综合考虑，选择甲醇-10 mmol/L甲酸/甲酸铵缓冲溶液(pH 3.0)为流动相。

2.2 前处理条件的优化

2.2.1 提取溶剂的选择针对TMT在不同溶液中存在不同形式和样品基质的特点，分别考察了甲醇、乙腈、乙腈-水(1∶1)、乙腈-1%甲酸水(1∶1)、乙腈-100 mmol/L甲酸/甲酸铵缓冲溶液(pH 3.0,1∶1)作为提取剂的提取效果。结果发现(表1)，乙腈和甲醇虽能较好地分散样品，但对TMT提取效果差，回收率为60%～70%左右。对于小麦粉(WF)和FTA1，提取溶剂乙腈-1%甲酸水(1∶1)较乙腈-水(1∶1)的提取效率均有所提高，回收率分别从81.9%和80.3%提高至94.2%和91.3%，分析原因可能是在此酸性提取环境下TMT更趋向于分子形式，易于被提取。然而这两种提取溶剂处理FTA2时出现成胶现象，给提取带来了困难。可能是含玉米淀粉及各种复合酶的FTA2遇水胶化所致。

进一步比较发现，乙腈-100 mmol/L甲酸/甲酸铵缓冲溶液(pH 3.0,1∶1)可使WF和FTA1的提取回收率提高至95.5%和92.1%，对于阳性小麦粉(WF-03)的提取效率提升至10.86 mg/kg，因此缓冲盐的加入有助于TMT总量的提取。且其处理FTA2时不胶化，分散性较好。因此，初步选择乙腈-100 mmol/L甲酸/甲酸铵缓冲溶液(pH 3.0,1∶1)作为提取溶剂。

表1 不同提取溶剂对TMT的提取效率(n=3)Table 1 Average efficiencies of TMT with different extraction solvent(n=3)

2.2.2 提取溶剂pH值的选择对乙腈-100 mmol/L甲酸/甲酸铵缓冲溶液(1∶1)的pH值(pH 2.0、2.5、3.0、4.0、6.5)进行考察，结果显示，随着pH值的降低，TMT的提取效率呈升高趋势，pH值为2.5时小麦粉和酶式处理剂的提取效率最高(回收率分别为95.9%和81.9%)，当pH值降至2.0时提取效率呈下降趋势。在pH 2.5的缓冲溶液中，TMT主要以分子状态存在，提取效率提高。综合考虑选择提取溶剂的pH值为2.5。

2.2.3 缓冲盐溶液浓度的优化对提取溶剂乙腈-甲酸/甲酸铵缓冲溶液(pH 2.5，1∶1)的缓冲盐浓度(10、20、50、100、200、500 mmol/L)进行考察。结果显示，随着缓冲盐浓度的升高，小麦粉中TMT的提取回收率变化不大，阳性小麦粉含量和酶式处理剂的提取效率呈升高趋势，缓冲盐浓度为100 mmol/L时提取效率最高，进一步提高盐浓度提取效率略有下降。因此选择提取溶剂的缓冲盐浓度为100 mmol/L。

2.2.4 提取溶剂中有机相含量的优化在pH<4.8时，TMT主要以H3TMT存在，该状态不易溶于水，因此需对提取溶剂的有机相含量进行优化。对乙腈-100 mmol/L甲酸/甲酸铵缓冲溶液(pH 2.5)中乙腈含量(40%、50%、60%、70%、80%、90%)进行考察，发现TMT的提取效率随着有机相含量的提高而升高。乙腈含量为80%时的提取效果最好，小麦粉和酶式处理剂的加标回收率分别达99.1%和96.0%，阳性样品的含量测定值为14.69 mg/kg。但有机相比例过高会影响缓冲溶液所提供的离子强度和pH值，导致提取效率下降，综合考虑选择80%的乙腈-缓冲溶液体系。综上，确定乙腈-100 mmol/L甲酸/甲酸铵缓冲溶液(pH 2.5，8∶2)为最终提取溶剂。

图2 不同净化方式对TMT回收率(A)与基质效应(B)的影响Fig.2 Effect of different purification method on recoveries(A) and matrix effects(B) of TMT WF,FTA2 and WF-03 mean wheat flour,flour treatment agent 2 and the positive wheat flour,respectively

2.2.5 取样量的选择分别对不同取样量(0.5、1、2、3、4 g)进行考察，结果发现随着取样量的增加，阳性样品(WF-03)含量和FTA2的回收率在1 g后呈下降趋势，过高的取样量影响了样品分散性和目标物的提取效率。取样量对于FTA1和小麦粉基质的提取效率影响不大，只是在取样量过高时(4 g)分别表现出回收率降低和偏高的情况。综合考虑取样代表性及方法灵敏度，对小麦粉及其添加剂均选择1 g的取样量。

2.2.6 净化方式的选择进一步比较了直接提取(A)、直接提取-稀释(B)、PRiME HLB(C)、QuEChERS 1(D，100 mg C18+900 mg MgSO4)、QuEChERS 2(E，150 mg C18+150 mg PSA+900 mg MgSO4)和PRiME HLB-稀释(F)6种净化方式的净化效果。

通过对TMT在小麦粉及添加剂中的平均回收率、阳性样品含量及基质效应的比较(图2A和B)可知，直接提取不净化在回收率和基质效应上均需进一步改善。D与E为两种QuEChERS净化包，对WF和FTA2的回收率及WF-03含量分别为122.1%、121%、15.7 mg/kg和76.4%、82.8%、12.6 mg/kg，表现出回收率过高和偏低，方式D的回收率偏高可能是TMT基质增强引起，方式E的回收率和阳性样品含量偏低可能是PSA对目标物有一定吸附所致。相比直接提取(A和B)和QuEChERS(D和E)，PRiME HLB(C和F)在提取效率和基质效应方面效果更好。方式F为在C基础上进一步稀释，在满足灵敏度的同时，可将基质效应控制在2%以下，相对标准偏差(RSD)也低于2.1%。PRiME HLB填料具有极强水浸润性，无需活化和平衡步骤，净化过程只吸附杂质，目标成分不保留，操作简单和效率高等优势。因此，本方法选择F为最终净化方式。

2.2.7 定容溶剂的考察考虑到溶剂效应及TMT易存在多种离子形式，对标准工作溶液的定容溶剂进行考察。首先比较乙腈-水(1∶9)和乙腈-10 mmol/L甲酸/甲酸铵(pH 3.0,1∶9)两种定容溶剂的影响，发现乙腈-水不能很好控制TMT的电离，色谱图上有少量离子形式峰的存在，后者能较好控制峰形。同时比较了不同乙腈含量的定容溶剂，发现乙腈含量在50%以下时，对目标物的峰形和保留时间均无明显影响。综合考虑确定标准工作溶液的定容溶剂为乙腈-10 mmol/L甲酸/甲酸铵(pH 3.0,1∶9)。

2.3 基质效应

按“1.2.3”步骤对小麦粉、酶式处理剂中TMT的基质效应进行评价，结果见图2B中方式F。研究发现，TMT在不同基质中基质效应差异不大，TMT的基质效应基本在±5%以内，完全满足定量需求。因此，本方法采用纯溶剂标准曲线定量，减少了匹配相同空白基质的难操作性及不同空白样品匹配的差异性。

2.4 方法学评价

2.4.1 线性范围、检出限与定量下限将标准储备液用乙腈-10 mmol/L甲酸/甲酸铵溶液(pH 3.0,1∶9)逐级稀释，得质量浓度分别为0.5、1.0、5.0、10.0、50、100、250 ng/mL的系列标准工作溶液。将该溶液以质量浓度从低到高的顺序，按“1.2.4”和“1.2.5”条件进行测定，以TMT定量离子对的峰面积(Y)对其质量浓度(X,ng/mL)作标准曲线。TMT在0.5～250 ng/mL范围内线性关系良好，线性回归方程为Y=805.04X+120.23，r2=0.997 7。采用空白基质加标的方法，以信噪比S/N=10得到目标物的定量下限(LOQ)为0.05 mg/kg，以S/N=3得到目标物的检出限(LOD)为0.02 mg/kg。

表2 小麦粉及添加剂中TMT的回收率及相对标准偏差(n=6)Table 2 Recoveries and RSDs of TMT in wheat flour and flour additives(n=6)

2.4.2 回收率与相对标准偏差分别在小麦粉、FTA1、FTA2阴性样品中添加0.10、1.00、10.0 mg/kg 3个浓度水平的TMT标准溶液，每个浓度水平重复测定6次，按照“1.2.2”方法进行提取净化后，采用本方法测定。TMT的平均回收率为95.0%～110%，RSD均不大于5.6%(见表2)。

2.5 实际样品测定

应用本方法对市售及稽查的42批次小麦粉及34批次面粉添加剂样品进行分析，面粉添加剂除了两类复合面粉处理剂外，还涉及双乙酰酒石酸单双甘油酯、聚赖氨酸盐酸盐、葡萄糖氧化酶、维生素C、酒石酸氢钾、皂荚糖胶等多种单一添加剂类别，方法适用性较好。其中有3批次小麦粉样品检出TMT，含量分别为0.221、2.25、14.6 mg/kg，面粉添加剂样品均未检出，阳性小麦粉的色谱图见图3。

3 结 论

本文建立了适用于小麦粉及其添加剂中TMT总量的超高效液相色谱-串联质谱测定方法。样品经乙腈-甲酸/甲酸铵缓冲溶液提取，采用无需活化的通过式Oasis PRiME HLB固相萃取柱净化，克服了面粉处理剂基质特殊性和TMT存在形式多样性带来的提取效率低的难题，实现了小麦粉及其添加剂中TMT总量的痕量检测。该方法样品前处理简便快速，定性、定量准确，灵敏度高，可满足小麦粉及其添加剂中非食用物质TMT总量的快速检测，可为进一步加强小麦粉质量控制提供技术支持。