基质辅助激光解吸电离-傅里叶变换离子回旋共振质谱法快速测定蔬菜中百草枯与敌草快

陈 超，潘佳钏，刘舒芹，郭鹏然*

(1.广东省科学院测试分析研究所(中国广州分析测试中心) 广东省化学危害应急检测技术重点实验室，广东 广州 510070;2.广东省科学院测试分析研究所(中国广州分析测试中心) 广东省原位电离质谱分析工程 技术研究中心，广东 广州 510070)

百草枯(1,1′-二甲基-4,4′-联吡啶二氯盐，Paraquat)和敌草快(1,1′-亚乙基-2,2′-联吡啶二溴盐，Diquat)均为联吡啶类阳离子季铵盐，具有高水溶性和低挥发性，属于非选择性触杀灭生型除草剂，因价格低廉，在全球范围内被广泛使用。由于百草枯和敌草快对人和动物具有很强的毒性[1-2]，因此它们在农业中的广泛使用引起了人们对其在食品中残留问题的关注。研究发现长期接触百草枯会增加帕金森病(PD)的发病风险，因此其也被认为是帕金森病的环境危险因素之一[3]。我国食品安全国家标准(GB 2763-2016)对蔬菜和水果中百草枯和敌草快残留均有明确限量要求，其中百草枯的最大残留限量为0.01～0.2 mg/kg，敌草快为0.01～0.1 mg/kg[4]。

目前，已被报道用于水果蔬菜中百草枯和敌草快含量测定的方法主要有液相色谱-质谱联用法(LC-MS)[5-7]、酶联免疫分析法(ELISA)[8]、表面增强拉曼光谱法(SERS)[9-10]、液相色谱法(HPLC)[11]和电化学法(EIS)[12-13]等。但这些方法大部分需要对蔬菜提取液进行净化处理，无法实现快速、高通量筛查。而基质辅助激光解吸电离(MALDI)分析技术因样品分散在固体基质中，能更有效地吸收激光能量，利用紫外或红外激光的脉冲辐射将待测物快速解析/电离成带正电荷或负电荷的离子[14]，可实现样品的快速、高通量分析。

傅里叶变换离子回旋共振质谱(FTICR-MS)则具有超高分辨率、灵敏度高、精确度高等优点，将MALDI与FTICR-MS联用，具有分析速度快、耐盐度好等优点[15-16]。鉴于此，本研究建立了一种利用MALDI-FTICR-MS测定蔬菜中百草枯和敌草快的方法，样品用含1%甲酸的乙腈溶液提取后，与MALDI基质混合即可直接进样分析，对于基质复杂的样品无需净化，提取后即可直接快速测定样品中微量的百草枯和敌草快，有效填补了蔬菜中百草枯和敌草快快速高通量筛查检测研究的空白。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

配有基质辅助激光解吸电离源的Solarix XR 7.0 T傅里叶变换离子回旋共振质谱仪(MALDI-FTICR-MS，德国Bruker公司)，配Smartbeam Ⅱ型固态激光器，最大能量300 μJ，频率在 0～1 kHz 内可调，波长为355 nm；数据处理软件(DataAnalysis 5.0，德国 Bruker 公司)；BSA224S 型电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司)；H1850型离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)；HR2534手持搅拌料理机(飞利浦中国投资有限公司)；JP-060S 型超声波清洗机(深圳市洁盟清洗设备有限公司)；VORTEX 1型旋涡混合器(德国IKA公司)。

百草枯(纯度为82.4%)、百草枯-D8(纯度为95.9%)、敌草快(纯度为96.4%)、敌草快-D4(纯度为93.4%)标准品均购自德国Dr Ehrenstorfer公司；2,5-二羟基苯甲酸(2,5-DHB，德国Bruker公司)；α-氰基-4-羟基肉桂酸和芥子酸(CHCA和SA，美国Sigma-Aldrich公司)；乙腈(色谱纯，美国Honeywell公司)；甲酸(LC-MS级，美国Thermo Fisher Scientific公司)；三氟乙酸钠校准溶液(NaTFA，美国Sigma-Aldrich公司)；实验用水为Milli-Q超纯水系统制备的超纯水；蔬菜样品均为当地市场购买。

1.2 标准溶液的配制

精密称取适量(精确至0.000 1 g)百草枯、敌草快、百草枯-D8和敌草快-D4标准品，用纯水溶解并定容，分别配成质量浓度为100 mg/L的储备液，置于塑料瓶中于-20 ℃保存。用溶剂或不同基质溶液分别配制含百草枯和敌草快质量浓度为5、10、20、50、100、200 μg/L的系列标准工作溶液；用乙腈-0.2%甲酸水溶液(体积比1∶1)将百草枯-D8储备液和敌草快-D4储备液稀释成质量浓度为100 μg/L的混合内标工作溶液。

1.3 样品制备

1.3.1 提 取取250 g蔬菜样品，用手持搅拌料理机直接匀浆，精密称取1 g(精确至0.001 g)于10 mL塑料离心管中，加入4 mL含1%甲酸的乙腈溶液混匀后，超声10 min，再涡旋1 min，在室温下以5 000 r/min离心5 min，取上清液定容至5 mL，混匀后备用。

1.3.2 点 样取10 μL上清液与10 μL混合内标工作溶液(100 μg/L)及20 μL CHCA(2 g/L，用30%乙腈水溶液配制)溶液混合均匀，准确量取3 μL该混合液点于MALDI靶板上，待液滴自然晾干(需等待5～10 min)形成均匀结晶层后进样分析。

1.4 质谱条件

在正离子模式下采用MALDI源，质量采集范围为m/z50～300，采样大小为2 M，累加次数为8，Skimmer(锥孔电压)为40 V；激光能量为40%，频率为100 Hz，激光点数为100 Shots，光斑为Medium，激光路径为Random。数据采集前，在ESI离子源模式下采用0.01 g/L三氟乙酸钠溶液(用50%乙腈水溶液配制)进行仪器校准；数据采集过程中锁定百草枯-D8内标离子m/z194.165 36进行实时校正，以保证数据采集中质量轴的准确性。定性分析离子对：百草枯m/z186.115 15 → 171.091 67，敌草快m/z184.099 50 → 183.091 67；百草枯和敌草快的定量离子分别为m/z186.115 15和m/z184.099 50，内标法定量(百草枯-D8和敌草快-D4参与计算的离子峰分别为m/z194.165 36和188.124 61)。

2 结果与讨论

2.1 MALDI基质类型与浓度的选择

前期实验[16]发现，当MALDI基质浓度选用10 g/L时，2,5-DHB和CHCA比SA更适用于百草枯测定时的辅助电离基质，而2,5-DHB可使方法检出限更低，这是因为在此浓度下CHCA的结晶层很厚，影响了待测物的激发。由于2,5-DHB和CHCA对联吡啶类化合物均有较强辅助电离作用[17]，本研究对比了低浓度2,5-DHB 和CHCA对百草枯和敌草快响应的影响。结果显示，当2,5-DHB的质量浓度低于10 g/L点样时，形成的结晶层太薄且不均匀，易产生“甜点效应”(由于基质-分子的共结晶不均匀，以及样品溶液晾干时的咖啡环效应，分子在基底上分布极其不均匀，产生分子聚集，使得检测时点与点之间信号差异特别大，导致信号很强的区域被称之为“甜点”；这种分子分布不均匀最终导致选点时存在偶然性以及主观性，不能对实验结果进行准确的分析)[18]；而CHCA的质量浓度为1 g/L时仍能形成均匀的结晶层，且百草枯和敌草快的响应比采用10 g/L时的2,5-DHB高5倍，因此实验选择CHCA为辅助电离基质。

本研究按“1.3”进行样品提取及点样，考察不同浓度CHCA分别与纯标准溶液(用空白溶剂配制，100 μg/L)和样品基质标准溶液(小白菜提取液，100 μg/L)等比例混合点样后的分析结果(图1)。由图可见，纯标准溶液与1 g/L CHCA混合后点样得到的百草枯和敌草快的响应最高，而样品基质配制的标准溶液在2 g/L CHCA中信号强度最高，与纯标液和样品基质配制的标液响应相近，且重复6次点样测试结果的相对标准偏差(RSD)为2.6%和4.8%，检出限满足检测要求[19]。故本方法最终选择质量浓度为2 g/L的CHCA为MALDI基质辅助用于样品中百草枯和敌草快的电离。

2.2 质谱条件的优化

本研究在前期实验[16]的质谱条件下进行了优化，发现用2 g/L CHCA为MALDI基质时，仪器激光能量和Skimmer电压分别提高至40%和40 V，且仪器未出现质量轴偏移的情况。在此质谱条件下，百草枯和敌草快产生3种类型的离子峰：百草枯m/z186.115 15、185.107 32和171.091 67，敌草快m/z184.099 50、183.091 67和157.076 02，与文献报道一致[20]。每种待测物选取一对响应高的离子峰作为定性分析的离子对，并以其中响应最高的离子峰作为定量离子，优化后的质谱条件见“1.4”。

2.3 提取条件的选择

百草枯和敌草快均为碱性阳离子型化合物，易溶于酸性水溶液而不溶于有机试剂[21]。在提取条件优化过程中，发现由于新鲜蔬菜的水分含量一般大于50%，若提取溶剂中水的比例过高或提取的物质浓度过高时，会导致百草枯和敌草快的质谱峰响应低且加标回收率均低于50%。同时，观察到MALDI靶板上的点样点形成的结晶层很厚且不均匀，这可能是因为高比例水会从样品中提取出大量糖类物质，从而形成紧密的类似胶状物的结晶层，使得待测物分散的不够均匀，且激光无法穿透过厚的样品层，影响待测物的离子化效率。参考文献报道[6,21]，分别选取乙腈-0.2%甲酸水溶液(1∶1)、含0.2%甲酸的乙腈溶液、含1%甲酸的乙腈溶液和含5%甲酸的乙腈溶液为提取溶剂，按“1.3”方法对空白小白菜进行加标回收实验(加标量为100 μg/L)。结果显示，采用含1%甲酸的乙腈溶液作为提取溶剂时的加标回收率最高，故最终选择含1%甲酸的乙腈溶液为提取溶剂。

2.4 方法学验证

2.4.1 专属性与基质效应的评价选取7种空白蔬菜(冬瓜、黄瓜、小白菜、上海青、韭菜、芹菜、生菜)在优化条件下提取和点样分析，采用精确分子量对应的质谱峰强度定量，发现百草枯、敌草快及其内标在7种空白蔬菜样品中定量定性离子峰位置均无干扰离子峰，专属性符合要求。

实验采用标准曲线斜率的比值评价基质效应(Matrix effects,ME)，其计算公式为ME=Ka/Kb，其中Ka为样品基质的校准曲线斜率，Kb为溶剂校准曲线的斜率。若ME=100%表明无基质效应，ME为80%～120%为弱基质效应，50%150%表示基质效应强[22]。由表1数据可知，7种蔬菜的ME均在80%～120%，表示虽然存在一定程度的基质效应，但影响不明显，因此可直接采用空白溶剂配制的标准曲线定量。

2.4.2 线性关系、检出限与定量下限以百草枯和敌草快的质量浓度为横坐标(x，μg/L)，对应待测物的定量离子与内标离子峰强度的比值为纵坐标(y)绘制标准曲线。结果显示，8种基质配制的标准溶液在2～200 μg/L质量浓度范围内线性良好，相关系数(r)为0.997 2～0.999 6(表1)。以3倍信噪比(S/N=3)计算得百草枯和敌草快在7种蔬菜基质中的检出限(LOD)分别为1.0～1.5 μg/kg和5.0～7.5 μg/kg，定量下限(LOQ，S/N=10)分别为3.0～4.5 μg/kg和15～23 μg/kg。本方法的检出限和定量下限虽逊于文献报道的LC-MS法[5-6]，但已可满足主要蔬菜品种中百草枯和敌草快的国家标准限量要求[1]，同时也满足标准SN/T 0293-2014[19]中的检出限(百草枯和敌草快的检出限均为10 μg/kg)要求。

表1 敌草快和百草枯在不同基质溶液中的基质效应(ME)、线性范围、线性方程、相关系数、检出限及定量下限Table 1 Matrix effects(ME),linear ranges,linear equations,correlation coefficients,LODs and LOQs of diquat and paraquat in different matrix solution

2.4.3 准确度与精密度分别以上述7种蔬菜空白样品，进行低、中、高3个浓度水平的加标回收实验，按“1.3”方法进行样品制备，每个浓度设6组平行实验，其准确度与精密度结果见表2。结果显示，百草枯和敌草快在7种蔬菜中的回收率分别为73.0%～109%和81.7%～117%，RSD分别为1.0%～8.2%和1.0%～7.0%，表明方法的回收率和精密度均能满足相关检测要求。

表2 敌草快和百草枯在7种蔬菜中的加标回收率和相对标准偏差(RSD，n=6)Table 2 Recoveries and relative standard deviations(RSD) of Paraquat diquat and paraquat in vegatables (n=6)

图2 韭菜中添加百草枯和敌草快(100 μg/kg)的质谱图Fig.2 Mass spectrogram of paraquat and diquat spiked in garlic chives (100 μg/kg)

2.5 实际样品测定

采用本文建立的方法对当地市场随机购买的7种蔬菜共14份样品中百草枯和敌草快进行快速检测，其中冬瓜、黄瓜、小白菜、上海青、韭菜、芹菜和生菜各2份，均未检出百草枯和敌草快。图2为韭菜基质中添加100 μg/kg百草枯和敌草快的质谱图。

3 结 论

本研究以含1%甲酸的乙腈溶液为提取溶剂，建立了蔬菜中百草枯和敌草快的MALDI-FTICR-MS检测方法，该方法于在30 min内即可获得测样结果，具有操作简单、分析速度快和灵敏度高等优点，对于基质复杂的样品无需经过净化处理，提取后即可直接快速测定样品中痕量的百草枯和敌草快，有望实现复杂生物样品中百草枯和敌草快的快速、高通量、高灵敏分析和检测。