截短新型冠状病毒N蛋白在荧光层析法上的应用

卢 瑶，牛卫东，徐 瑾，李玉林，王继创， 李永伟，张 恒，王云龙,7,1*

(1.新乡医学院 医学检验学院，河南 新乡 453000;2.河南省生物技术研究中心，河南 郑州 450000； 3.郑州市疾病预防控制中心，河南 郑州 450000；4.河南省疾病预防控制中心，河南 郑州 450000； 5.河南中医药大学 第二临床医学院，河南 郑州 450000；6.河南省职工医院，河南 郑州 450000； 7.郑州职业技术学院，河南 郑州 450000)

2019年12月以来，武汉市部分医院相继报告了多例无法解释的肺炎。由于春节期间人口流动性很高，2020年1月该肺炎迅速传播到整个中国[1]，同时证实其是由新型冠状病毒(SARS-CoV-2，以前称为2019-nCoV)引起的急性呼吸道疾病[2]，并被命名为新型冠状病毒肺炎(COVID-19)。2020年1月30日，世界卫生组织(WHO)正式宣布COVID-19已经成为国际关注的突发公共卫生事件[3]。到目前为止，这种疾病已经迅速传播到中国的其他地区和66个国家。在中国新病例数量有所减少的情况下，美国、意大利和西班牙在内的其他国家的新病例却呈指数增长[4]。传染源主要是SARS-CoV-2感染患者，包括无症状感染者。该疾病的传播途径主要为直接传播、气溶胶传播和接触传播[5-6]。SARS-CoV-2感染患者通常表现为肺炎样症状(发热、干咳和呼吸困难等)和腹泻等胃肠道症状，其次为严重急性期呼吸道感染，部分病例会出现急性呼吸窘迫症合并严重呼吸道并发症，甚至导致死亡[7-8]。至今已研发出多种针对COVID-19的疫苗，但仍没有特定的药物治疗方案出现，早期诊断并及时管控，是阻止疫情进一步散播的关键[9]。因此，加强疫情监控，及时筛查并确诊SARS-CoV-2感染者是疫情防控的首要任务[10]。

目前对COVID-19患者的检测主要采用荧光定量聚合酶链式反应(PCR)法、化学发光法以及胶体金法。荧光定量PCR法检测人体内提取出的核酸时灵敏度较低，容易出现假阴性，同时由于此类方法的检测时间长，对于检测环境的要求高，不宜于基层医院普及[11]；化学发光法和胶体金法方便快速，成本低，应用范围广，技术难度系数相对较低，但存在灵敏度较低等局限[12]。近年来荧光层析免疫技术不断成熟，该技术操作简便、易自动化，可有效排除非特异荧光的干扰，分析灵敏度有了很大提高[13]。

SARS-CoV-2核衣壳(N)蛋白是一种丰富的RNA结合蛋白，可在病毒的生命周期中发挥多种作用[14]。N蛋白相对保守，在病毒的结构蛋白中所占比例最大，感染早期机体即能产生抗N蛋白的高水平抗体。目前已在确认的COVID-19患者稀释度不同的血清中检测到针对N蛋白的IgG和IgM抗体存在，该结果进一步证实可以利用N蛋白建立快速检测 SARS-CoV-2 的血清抗体方法[15]。但靶向保守的 N1b 和 N2b 结构域的患者抗体可能与相关冠状病毒如SARS-CoV的核衣壳发生交叉反应，特异性较低[16]。河南省生物工程技术研究中心制备的截短N蛋白(NC蛋白)截取了SARS-CoV-2 N蛋白C末端301～419的119个氨基酸对应片段，相较于N 蛋白的全长片段(NF蛋白)具有较强的特异性。因此可基于这两种蛋白进行研究，根据配对检测结果选择较优组合。

本研究基于NC蛋白建立了SARS-CoV-2抗体荧光免疫层析检测方法，通过对其精密度和稳定性进行评价，配合相应的荧光分析仪，实现了人体内SARS-CoV-2抗体水平的评价。整套系统操作简便，成本低廉，能够在15 min内即时完成检测，大大降低了检测时间，可有效提升复工复学群体的检测效率。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

荧光微球(FMs,美国Bangs Lab公司)，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)(中国Aladdin公司)，2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物(MES)缓冲液、样品稀释液、包被液、微球保护液、微球封闭液、羊抗鼠IgG、鼠IgG、NF蛋白、BL21(DE3)/pET21b-NC菌株、SARS-CoV-2阴性样本和免疫NC抗原两周的兔血清(中国河南省生物工程技术研究中心)。

PVC板和吸水纸(中国通成纸业)，玻璃纤维素膜(中国JY Biotech公司)，XYZ三维点膜喷金仪和微电脑自动斩切机(中国上海金标生物科技有限公司)，荧光免疫层析读数仪(中国杭州峰航科技有限公司)，高电流电泳仪(美国Bio-Rad公司)。

1.2 实验原理

本实验采用双抗夹心法检测血清中SARS-CoV-2抗体的水平。将待测血清和样本稀释液按照一定比例混合后加入加样孔中，血清中的SARS-CoV-2抗体会和结合垫上的荧光标记抗原结合形成抗原-抗体复合物，并通过毛细作用沿着液体层析方向移动，随后通过层析作用逐渐在硝酸纤维素膜(NC膜)上移动，最后被固定在检测线(T线)上的包被抗原特异性地捕获，形成抗原-抗体-抗原复合物，而鼠IgG继续移动与质控线(C线)上的羊抗鼠IgG抗体结合。其原理如图1所示。当检测卡插入荧光检测仪后，仪器自动读取检测卡上T线和C线的荧光信号强度，T/C值可表示待测血清中SARS-CoV-2抗体的水平[17]。

图1 SARS-CoV-2荧光免疫层析试纸条原理图Fig.1 The schematic diagram of SARS-CoV-2 fluorescent immunochromatographic strip FMs-(labeled antigen) FMs-(mouse IgG) Coated antigen Goat-anti-mouse IgG SARS-CoV-2 antibody FMs-(labeled antigen)-(SARS-CoV-2 antibody) FMs-(labeled antigen)-(SARS-CoV-2 antibody)(coated antigen) FMs-(mouse IgG)-(goat-anti-mouse IgG)

1.3 NC蛋白的制备及纯化

1∶100接种菌株BL21(DE3)/pET21b-NC于1.2 L Luria-Bertani(LB)液体培养基中(含100 μg/mL 氨苄青霉素)，37 ℃条件下振荡培养至OD600 nm≈0.8～1.2。温度降至16 ℃后，加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度0.2 mmol/L并诱导20 h，8 000 r/min离心10 min收集菌体，20 mmol/L Tris(pH 8.0，300 mmol/L NaCl)缓冲液重悬菌体，超声破碎(250 W，超声3 s，间隙3 s)20 min，12 000 r/min离心10 min，收集上清液，滤纸过滤后上样Ni2+亲和层析柱。

1.4 荧光微球活化

取1%固含量的200 nm荧光微球40 μL于1.5 mL离心管中，加入1 mL纯化水后在15 000 r/min条件下离心15 min。弃上清液后加入1 mL 20 mmol/L MES (pH 6.0)缓冲液振荡混匀，再加入10 mg/mL EDC溶液30 μL，振荡混匀，继续加入20 mg/mL NHS溶液80 μL，水浴超声 120 s混匀。将其置于台式恒温振荡器中避光活化30 min，然后在15 000 r/min条件下离心15 min，弃上清液后加入1 mL 20 mmol/L MES (pH 6.0)缓冲液，超声混匀。

1.5 荧光微球偶联物的制备

在上述溶液中加入待标记抗原30 μg振荡混匀，避光条件下偶联1 h，继续加入20 μg鼠IgG，避光条件下偶联1 h。偶联完成后，于15 000 r/min条件下离心15 min，弃上清液，加入封闭液1 mL，超声混匀避光条件下封闭1 h。封闭完成的荧光微球于15 000 r/min条件下离心15 min，弃上清液，加入微球保护液1 mL，超声混匀。

1.6 试纸条的制备

将包被抗原和羊抗鼠IgG喷于硝酸纤维素膜的T线和C线上，质量浓度均为0.5 mg/mL，两带间隔4 mm，置于真空干燥箱中抽真空干燥2 h。将制备的荧光微球偶联物稀释后用XYZ喷金划膜仪喷涂于结合垫上，置真空干燥箱中抽真空干燥5 h。将样品垫、结合垫以及吸水纸按照一定顺序组装在PVC板上，使用微电脑自动斩切机将组装好的PVC板切成宽度为3.9 mm的试纸条(试纸条结构示意图如图2所示)，将试纸条装入特定的塑料检测卡中，以压卡机压紧检测卡上下盖，置于干燥房待用。

图2 SARS-CoV-2荧光免疫层析试纸条结构示意图Fig.2 Structural diagram of SARS-CoV-2 fluorescent immunochromatographic strip

1.7 试纸条的检测

在室温下将待测血清和样本稀释液按照一定比例混合，用移液器吸取80 μL稀释后的血清，垂直悬空缓慢加入到样品垫上，15 min后在荧光免疫层析读数仪上进行检测，读取对应的T、C值。无论样品中是否含有SARS-CoV-2抗体，C 线都应出现荧光条带，否则试纸条检测结果判定为无效。试纸条检测结果示意图如图3所示[18]。

图3 SARS-CoV-2荧光免疫层析试纸条检测结果示意图Fig.3 Schematic diagram of detection results by SARS-CoV-2 fluorescent immunochromatographic strip

图4 NC蛋白的SDS-PAGE鉴定结果Fig.4 SDS-PAGE analysis of NC protein M.protein molecular weight marker ;1.BL21(DE3)/pET21b-NC non-inducted;2.BL21(DE3)/pET21b-NC inducted with IPTG for overnight;3.purified NC protein

2 结果与讨论

2.1 NC蛋白的制备及纯化

本实验在对重组菌株BL21(DE3)/pET21b-NC进行培养后，使用镍亲和层析法纯化蛋白，以含100 mmol/L咪唑的20 mmol/L Tris(pH 8.0，300 mmol/L NaCl)缓冲液洗涤杂蛋白，含300 mmol/L咪唑上述Tris的缓冲液洗脱目的蛋白。20 mmol/L Tris(pH 8.0)缓冲液透析目的蛋白除去咪唑和NaCl后，以十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定，结果见图4。纯化后得到了单一的目的条带，大小约13 kD。

2.2 配对抗原筛选

本实验选择NF蛋白以及NC蛋白进行配对组合，使用时间分辨免疫层析法对其阴性和阳性进行评价，综合筛选出较优抗原配对组合。抗原配对方式为两组，均选择NF蛋白作为包被抗原，a组使用NF标记，b组使用NC标记，按照“1.4”、“1.5”以及“1.6”中的方法制备试纸条。

将兔血清稀释10、20、40、80、160倍，并编号为P1、P2、P3、P4、P5，使用研制的试剂卡进行检测，T值大于1 000，且T/C大于0.1即为符合要求；同时设置平行组，并在此基础上使用样本稀释液对兔血清进行稀释，直至检测结果不符合阳性检测标准，结果见表2。a组(NF包被，NF标记)P3(血清稀释至40倍时)样品的T值仍大于1 000，且T/C大于0.1，P4(血清稀释至80倍)样品的T值小于1 000，不符合阳性检测标准；b组(NF包被，NC标记)P4(血清稀释至80倍)样品的T值仍大于1 000，且T/C大于0.1，P5(稀释至160倍)样品的T值小于1 000，不符合阳性检测标准。由此可见，b组的灵敏度优于a组。综合阴性和阳性检测结果，选择b组(NF包被，NC标记)抗原配对组合进行性能检测。

表1 SARS-CoV-2荧光免疫层析试纸条阴性检测结果Table 1 Negative detection results of SARS-CoV-2 fluorescent immunochromatographic strip

表2 SARS-CoV-2荧光免疫层析试纸条阳性检测结果Table 2 Positive detection results of SARS-CoV-2 fluorescent immunochromatographic strip

2.3 精密度实验

本实验选择N2、N15、P1、P3以及P5 5份样本，分别对同批次试纸条进行批内精密度检测，再分别对3个不同批次的试纸条进行批间精密度检测，每个待检样本重复检测10次。计算每个待检样本的CV值，对批内和批间精密度进行考察，结果见表3。批内各样品T/C值的CV范围为3.48%～10.05%；批间各样品T/C值的CV范围为4.77%～11.73%。批内以及批间的CV均小于15%，在允许范围之内。

表3 SARS-CoV-2荧光免疫层析试纸条批内及批间精密性检测结果Table 3 Intra-assay and inter-assay precision of SARS-CoV-2 fluorescent immunochromatographic strip

表4 SARS-CoV-2荧光免疫层析试纸条特异性检测结果Table 4 Specificity detection results of SARS-CoV-2 fluorescent immunochromatographic strip

2.4 特异性实验

根据《2019新型冠状病毒抗原/抗体检测试剂注册技术审评要点》选择肺炎支原体、甲型流感病毒、乙型流感病毒以及EB病毒阳性血清各3份，每份血清使用本实验构建的试纸条重复检测5次。另外检测3份阴性对照血清，重复5次，分析其特异性。结果见表4，所有4种病毒阳性的血清以及阴性对照血清的检测结果均为阴性，说明该试纸条有良好的特异性。

图5 SARS-CoV-2荧光免疫层析试纸条稳定性实验结果Fig.5 Stability detection results of SARS-CoV-2 fluorescent immunochromatographic strip

2.5 加速稳定性实验

将试纸条与干燥剂一起放入铝箔袋中密封后，置于37 ℃干燥箱中保存。分别在3、6、9、12、15、18、21 d时取出，于常温环境中检测。每个待检样本平行测定 3 次取平均值，样本稀释液4 ℃保存，考察其稳定性。结果见图5。试纸条在37 ℃干燥箱保存3、6、9、12、15、18、21 d 后，T值与放入当天相比变化均在15%以内，说明其稳定性良好，可在37 ℃条件下保存21 d。

2.6 方法学对比

随机抽取本实验制备的37个试纸条与广州万孚生物技术股份有限公司生产的新型冠状病毒抗体检测试剂盒(胶体金法)同时对37份COVID-19患病者血清进行检测；并使用两种方法检测118例非COVID-19患病者血清，其中其他发热伴呼吸道症状病例为76份，计算其符合率，结果见表5。两种方法的总符合率为96.13%，阳性符合率为90.63%，阴性符合率为97.56%。表明两种方法之间的相关性良好，本文所研制的试纸条具有一定的商用价值。

表5 研制试纸条和胶体金法试剂盒方法学对比结果Table 5 Comparative evaluation results of developed strip and immunological gold-labeled kit

3 结 论

本实验基于截短新型冠状病毒N蛋白开发的荧光免疫层析试纸条能够快速评价体内SARS-Cov-2抗体水平，批内和批间的精密性均小于15%，可37 ℃条件下稳定保存21 d，不需要庞大的人力物力，有效节约了资源，有利于基层单位新型冠状肺炎的检测，对疫情的防控也具有一定的现实意义。但该方法也存在一定的局限性，一方面，抗体的产生需要一定的时间，新型冠状病毒肺炎在潜伏期时体内并未产生抗体；另一方面，不同个体间感染病毒后抗体出现的时间也存在差异，因此该方法无法排除潜伏期和感染初期患者。