4种鸡源致病性沙门氏菌多重PCR检测方法的建立及应用

刘东海，王慧真，姜婷婷，邓云贵，李 想，张凯迪，刘彦威,2,3，刘 娜,2,3，崔国林,2,3*

(1.河北工程大学生命科学与食品工程学院，河北邯郸 056038；2.河北省禽病工程技术研究中心，河北邯郸 056038；3.邯郸市动物医学重点实验室，河北邯郸 056038)

沙门氏菌病是导致鸡只健康问题和蛋肉品质下降的主要细菌类传染病，沙门氏菌(Salmonella)血清型众多，至今有2600多种[1]，且均具有致病性[2]。肠炎沙门氏菌(Salmonellaenteritidis，SE)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium,ST)、鸡白痢沙门氏菌(Salmonellapullorum,SP)和鸡伤寒沙门氏菌(Salmonellagallinarum,SG)是我国当前养鸡场主要沙门氏菌流行血清型。鸡白痢沙门氏菌和鸡伤寒沙门氏菌表型形似、O抗原相同，分别引起雏鸡白痢和禽伤寒，导致鸡群高死亡率[3]。肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌具有广泛宿主嗜性，感染成年鸡后一般呈隐性经过，但可垂直传染给下一代或通过肉和蛋等制品引起人类食物中毒。在世界各地食物中毒事件中，沙门氏菌食物中毒居首位，其中肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌排在前两位[4]。在已经完成鸡白痢沙门氏菌净化的养鸡场，肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌成为主要沙门氏菌流行血清型，且因其极强的水平传播能力，不易通过类似鸡白痢沙门氏菌种源途径净化。

多重PCR方法具有快速、灵敏、通量高等优点，已广泛用于沙门氏菌检测。沙门氏菌血清型众多，在食品、环境、不同种动物中的主要流行血清型各异，不同领域研究者已建立多种血清型沙门菌多重PCR鉴定方法。如区分食品中肠炎、鼠伤寒、伤寒、婴儿沙门氏菌的多重PCR方法[4-5]；区分禽肠炎、鼠伤寒、鸡白痢、鸡伤寒、都柏林沙门菌氏菌的多重PCR方法[1,3,6-7]。近年来，一些新的具有沙门氏菌型鉴别意义的基因被鉴定，研究据其建立沙门氏菌多重PCR方法，进一步完善沙门氏菌鉴定系统。

invA是沙门氏菌SPI-1组成基因，仅存在于沙门氏菌属，普遍用于沙门氏菌属鉴定[8]。试验发现lygD基因内部Sdf I片段特异性出现于肠炎沙门氏菌，可作为肠炎沙门氏菌鉴别靶标[9]。STM4497仅出现于鼠伤寒沙门氏菌，可将其作为鼠伤寒沙门氏菌鉴别靶位[9]。与其他沙门氏菌不同，鸡白痢沙门氏菌和鸡伤寒沙门氏菌无鞭毛，鞭毛分泌系统基因flhB缺失197 bp核酸片段[10]，该片段区域可用于鸡白痢沙门氏菌和鸡伤寒沙门氏菌快速鉴定。本研究以invA、lygD(Sdf I)、STM4497、flhB为靶位建立多重PCR，测定该方法的特异性和灵敏度，并对河北地区蛋种鸡细菌分离株进行鉴定。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂 2×TaqMix，康润生物公司产品；BPW、TTB培养基、沙门氏菌生化鉴定试剂盒，北京陆桥公司产品；细菌基因组DNA提取试剂盒，北京索莱宝公司产品；沙门氏菌显色培养基，法国科玛嘉公司产品；沙门氏菌标准血清，宁波天润公司产品。

1.1.2 菌株来源 金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、痢疾志贺氏菌(Shigelladysenteriae)、粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)、卡他莫拉菌(Moraxellacatarrhalis)、支气管败血波氏杆菌(Bordetellabronchiseptica)、多杀性巴氏杆菌(Pasteurellamultocida)、大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)、肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)、盲肠肠球菌(Enterococcuscecorum)由本实验室保存。

肠炎沙门氏菌(Salmonellaenteritidis，ATCC13076)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium，ATCC14028)、鸡白痢沙门氏菌(Salmonellapullorum，ATCC13036)、鸡伤寒沙门氏菌(Salmonellagallinarum，ATCC9184)、猪霍乱沙门氏菌(Salmonellacholeroesuis)、科特布斯沙门氏菌(Salmonellakottbus)、都柏林沙门氏菌(Salmonelladublin，CVCC3760)、鸭沙门氏菌(Salmonellaanatum)、山夫登堡沙门氏菌(Salmonellasenftenberg)、埃皮耶姆沙门氏菌(Salmonellaapeyeme)由中国农业大学苏敬良教授惠赠。

1.1.3 主要仪器 NanoDrop超微量核酸蛋白定量仪，Thermo Fisher公司产品；Biometra TOne PCR仪，德国耶拿分析仪器有限公司产品；164-5050电泳仪，美国Bio-Rad公司产品；Amersham Imager 600凝胶成像系统，美国GE公司产品。

1.2 方法

1.2.1 沙门氏菌分离与血清分型 2018年1月至2021年3月，从河北省某大型蛋种鸡企业3家孵化场、4家育雏场、10家产蛋场的终止胚、雏鸡、死淘鸡、鸡粪、鸡舍环境中收集6 500份样品，经BPW预增菌、TTB选择性增菌、沙门氏菌显色培养基选择性培养和纯化后，用沙门氏菌生化试纸条进行菌种鉴定，用沙门氏菌O1～O12混合标准血清进行凝集试验，如出现凝集，用沙门氏菌标准血清O4、O9、Hi、Hg、Hm进行凝集试验，确定分离株血清型。

1.2.2 引物设计 选择沙门氏菌属的肠炎、鼠伤寒、鸡白痢/鸡伤寒沙门氏菌特异性基因，用Primer Premier 6软件设计引物(表1)。

表1本研究使用的引物

1.2.3 细菌DNA模板提取 肠炎沙门氏菌(ATCC13076)、鼠伤寒沙门氏菌(ATCC14028)、鸡白痢沙门氏菌(ATCC13036)、鸡伤寒沙门氏菌(ATCC9184)挑取单菌落，接种TSB培养基，37℃过夜培养后，吸取1 mL 菌悬液，12 000 r/min 离心2 min，弃上清，用PBS缓冲液1 mL 洗涤菌体2次，12 000 r/min 离心2 min，弃上清液，沉淀重悬于200 μL三蒸水中，再按照细菌基因组DNA提取试剂盒步骤提取细菌基因组，经NanoDrop超微量核酸蛋白定量仪测定核酸浓度，置-20℃保存。

1.2.4 PCR反应程序 以肠炎沙门氏菌(ATCC13076)、鼠伤寒沙门氏菌(ATCC14028)、鸡白痢沙门氏菌(ATCC13036)、鸡伤寒沙门氏菌(ATCC9184)基因组(100 ng/μL)为模板，建立20 μL反应体系：2×TaqMix 10 μL，模板1 μL，invAF 0.4 μL，invAR 0.4 μL，STM4497F 1 μL，STM4497R 1 μL，SdfF 0.4 μL，SdfR 0.4 μL，flhBF 0.4 μL，flhBR 0.4 μL，无菌水4.6 μL。反应条件：95℃ 5 min；95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 1 min，30个循环；72℃ 5 min。PCR产物经15 g/L琼脂糖凝胶电泳(120 V 30 min)后，通过凝胶成像系统拍照。

1.2.5 灵敏度检测 设定每个反应体系中肠炎、鼠伤寒、鸡白痢/鸡伤寒沙门氏菌基因组DNA含量分别为5、0.5、0.05、0.005 ng，利用优化的多重PCR方法检测，确定多重PCR方法对细菌基因组DNA灵敏度。设定每个反应体系中肠炎、鼠伤寒、鸡白痢/鸡伤寒沙门氏菌细菌数量分别为1×105CFU、1×104CFU、1×103CFU、1×102CFU、1×101CFU、1×100CFU、1×10-1CFU、1×10-2CFU，利用优化的多重PCR方法检测，确定多重PCR方法对细菌灵敏度。

1.2.6 特异性检测 用优化的多重PCR方法，分别检测葡萄球菌、痢疾志贺氏菌、粪肠球菌、卡他莫拉菌、支气管败血波氏杆菌、多杀性巴氏杆菌、大肠埃希氏菌、肺炎克雷伯菌、盲肠肠球菌、肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、科特布斯沙门氏菌、都柏林沙门氏菌、鸭沙门氏菌、山夫登堡沙门氏菌、埃皮耶姆沙门氏菌，确定多重PCR方法特异性。

1.2.7 临床样本检测 用优化的多重PCR方法，检测1.2.1中沙门氏菌分离株，调查河北地区规模化蛋种鸡生产链中沙门氏菌污染和感染现状。

2 结果

2.1 多重PCR方法的建立

根据沙门氏菌属的肠炎、鼠伤寒、鸡白痢/鸡伤寒沙门氏菌特异性基因和多重PCR产物长度需求，分别重新设计invA、Sdf、flhB引物序列，使两条电泳带距离不小于100 bp。引物浓度均为0.2 μmol/L和0.5 μmol/L时，STM4497基因亮度较弱；保持其他引物浓度为0.2 μmol/L，提高STM4497引物浓度至0.5 μmol/L时，各菌株条带亮度均较强。确定invA、Sdf I、STM4497、flhB引物浓度分别为0.2 、0.2、0.5、0.2 μmol/L(图1A)。55℃～62℃时鸡白痢/鸡伤寒沙门氏菌flhB条带亮度无明显差异，鼠伤寒沙门氏菌flhB条带亮度在58℃升至最高，Sdf I和STM4497条带均较亮。确定最优退火温度为58℃(图1B、图1C)。

A.引物浓度筛选 1～2.引物浓度均为0.2 μmol/L和0.5 μmol/L；3.invA、Sdf I、flhB引物浓度为0.2 μmol/L，STM4497引物浓度为0.5 μmol/L B～C.退火温度筛选 1～8.55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃；N.无菌水

2.2 灵敏度分析

SdfI、flhB、STM4497引物的检测灵敏度为0.05 ng，invA引物的检测灵敏度为0.5 ng，综合判定多重PCR的核酸浓度检测灵敏度为0.5 ng(图2A)。沙门氏菌菌落数目灵敏度检测见图2B、图2C，SdfI引物的检测灵敏度可至10 CFU，STM4497、flhB、invA引物的检测灵敏度可至100 CFU，综合判定多重PCR的菌落数目检测灵敏度为100 CFU。

A.基因组DNA灵敏度检测，1～4.反应体系模板含量分别为5、0.5、0.05、0.005 ng；B～C.细菌灵敏度检测，1～8反应体系细菌数目分别为1×105、1×104、1×103、1×102、1×101、1×100、1×10-1 、1×10-2 CFU

2.3 特异性分析

肠炎和鼠伤寒沙门氏菌均出现特异性的3个条带，鸡白痢和鸡伤寒沙门氏菌均出现特异性的2个条带，其他6种沙门氏菌出现特异性的2个条带，其他环境或肠道细菌均未出现条带(图3)。

1～10.鸡白痢沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、科特布斯沙门氏菌、都柏林沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、鸭沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、埃皮耶姆沙门氏菌、山夫登堡沙门氏菌；11～19.金黄色葡萄球菌、痢疾志贺氏菌、粪肠球菌、卡他莫拉菌、支气管败血波氏杆菌、多杀性巴氏杆菌、大肠埃希氏菌、肺炎克雷伯菌、盲肠肠球菌；N.无菌水

2.4 临床样本检测分析

从6 500份种鸡场样品中共分离到343株沙门氏菌，分离率为5.28%。通过生化试验、平板凝集试验和多重PCR对分离株进行鉴定和血清分型，两种方法的符合率100%(图4和表2)。沙门氏菌分离株中，肠炎沙门氏菌295株、鼠伤寒沙门氏菌10株、鸡白痢/鸡伤寒沙门氏菌2株、未定型沙门氏菌36株，分别占沙门氏菌分离株的86.01%、2.92%、0.58%、10.50%。肠炎沙门氏菌是河北地区蛋种鸡生产链中沙门氏菌主要流行血清型。

1～16.临床样本；SE.肠炎沙门氏菌；ST.鼠伤寒沙门氏菌；SP.鸡白痢沙门氏菌；SG.鸡伤寒沙门氏菌；N.无菌水

表2临床分离菌株平板凝集试验和多重PCR鉴定

3 讨论

鸡白痢和鸡伤寒沙门氏菌属专嗜性沙门氏菌，主要为垂直引起鸡较高死亡率。北美和澳大利亚等已基本清除商品鸡中的鸡白痢和鸡伤寒沙门氏菌[11]，我国规模化种鸡场也基本实现了鸡白痢沙门氏菌净化，但我国商品鸡中鸡白痢沙门氏菌仍普遍存在[12]。与鸡白痢沙门氏菌不同，肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌可感染鼠类、鸟类及人等多种生物，既可垂直传播也可水平传播感染鸡只，是鸡白痢沙门氏菌净化场区主要流行血清型，不易通过种源净化清除。不同血清型沙门氏菌感染场区，防控和净化策略也不同，及时准确鉴定场区沙门氏菌血清型具有重要意义。

传统沙门氏菌鉴定采用选择培养基培养纯化、生化鉴定和血清平板凝集试验分型，成本高、工作量大、需专业操作人员，且平板凝集试验易出现假阳性。基于沙门氏菌特异性基因的PCR方法具有快速、灵敏和准确等优点，适于沙门氏菌快速鉴定。多重PCR是在单基因PCR基础上发展起来的检测方法，可实现2种以上基因同时检测，进一步提升PCR检测速度和通量。参考前人发现的沙门氏菌属的肠炎、鼠伤寒、鸡白痢/鸡伤寒沙门氏菌特异性基因设计引物，成功建立一种同时检测以上血清型沙门氏菌的多重PCR方法，该方法的检测灵敏度达100 CFU细菌和0.5 ng基因组DNA。非特异性扩增是单重PCR常见的问题，为防范这一问题，研究为每种血清型沙门氏菌设计不少于两套引物，极大地提高结果的特异性，如沙门氏菌属、鸡白痢/鸡伤寒沙门氏菌均由invA和flhB2个基因共同鉴定，肠炎沙门氏菌由invA、Sdf I、flhB3个基因共同鉴定，鼠伤寒沙门氏菌由invA、STM4497、flhB3个基因共同鉴定。

用建立的多重PCR方法对2018年-2021年河北地区某大型蛋种鸡企业生产链上下游17家场区进行沙门氏菌流行情况调查，仅从2018年样品检出2株鸡白痢/鸡伤寒沙门氏菌，2019年-2021年均未检出，提示鸡白痢/鸡伤寒沙门氏菌在该企业已实现净化；86.01%沙门氏菌分离株属于肠炎沙门氏菌，提示肠炎沙门氏菌已成为河北地区规模化蛋种鸡场沙门氏菌主要流行血清型，因此沙门氏菌防控策略应作出对应调整。