布氏锥虫的蛋白质翻译后修饰研究进展

李丹阳，张乃文，关天东，姜 宁

(沈阳农业大学，辽宁沈阳 110866)

布氏锥虫(Trypanosomabrucei)属于真核单细胞原生寄生生物，分为布氏锥虫冈比亚种(T.bruceigambiense)、布氏锥虫罗德西亚亚种(T.bruceirhodesiense)以及布氏锥虫指名亚种(T.bruceibrucei)，前2种主要感染人类，引起人的非洲睡眠病；第3种主要感染动物，引起动物的那加纳病。布氏锥虫属于锥体科锥体属，传播媒介是采采蝇，属舌蝇属。采采蝇通过叮咬吸食体内有布氏锥虫的人类和动物，将锥虫传递给新的宿主[1]。感染非洲锥虫后，患者大部分都会出现嗜睡、昏迷的症状。症状通常分为两个阶段：第一阶段为血液淋巴期，在此期间锥虫寄生繁殖于患者的血液和淋巴液等处，引起血管、淋巴管的周围炎症，患者出现精神疲惫、体温升高、肌肉疼痛、淋巴结肿大以及贫血等临床症状；第二阶段为脑膜炎期，此时布氏锥虫已入侵中枢神经系统。患者将会出现一些神经症状，比如头晕头痛、昏沉欲睡、四肢痉挛等等。如不及时的进行救助和治疗，患者将持续嗜睡昏迷，最终导致身体衰竭，最终死亡[2]。但现有药物都具有很强的副作用，具有肾毒性和神经毒性等，因此寻找新型药物靶标迫在眉睫。

蛋白质翻译后修饰(post-translational modifications,PTMs)作为布氏锥虫各项功能的重要调节步骤，在其生活史中不可或缺。研究布氏锥虫蛋白质PTMs的种类、对虫体的调控机制以及修饰的关键位点，可以此为突破口，推进以布氏锥虫为病原的人畜共患疾病的药物靶点研究和药物研制，对现有的抗锥虫药物具有十分重要的意义。

1 布氏锥虫的蛋白质翻译后修饰

许多寄生原虫拥有复杂的生活史，在其生活史中，通过相关的基因表达调控，从而改变形态学和生理学的特征。在动基体寄生虫中，尤其是锥虫，缺乏转录调节因子，主要依赖多顺反子进行转录，所以导致转录能力有很大程度的受限，但可以通过蛋白质翻译和翻译后修饰进行相关的调节[3]。翻译后修饰发生于蛋白质生物合成的较后步骤，是指在蛋白质合成后所发生的共价的、由酶驱动的蛋白质修饰。现在已发现有300多个不同种的PTMs，包括磷酸化、乙酰化、甲基化、泛素化和泛素样修饰等。PTMs对于生物体有着广泛的功能，增加其蛋白质组的复杂性，改变相关蛋白质的定位，促进或阻止蛋白质之间的相互作用，激活或失活相关蛋白质，同时还可对相关蛋白质的结构进行细微地调整。许多PTMs是可逆的反应，可根据生物体的细胞周期阶段和定位进行调节，发生于蛋白质生命周期的任何时刻，这些PTMs的动态调节是由专门的酶催化。在布氏锥虫中，基因表达的调节元件RNA结合蛋白均经历了广泛的PTMs。布氏锥虫与伊氏锥虫亲缘关系很近，这两种锥虫在基因组上非常相似，均缺乏存在于多顺反子单位中的RNA聚合酶Ⅱ启动子和基因[4]，但形态和生活史却截然不同，它们之间的差异主要在于各自的蛋白质稳态以及PTMs的动态变化的不同[5]。修饰之后的蛋白质在各个细胞器中分布广泛，参与了锥虫的信号转导、翻译、RNA处理、转运和蛋白质转换等重要的生物学过程。

1.1 布氏锥虫常见的蛋白质修饰

1.1.1 磷酸化修饰 蛋白质磷酸化对于细胞功能是一个主要的调节机制，通过无凝胶、基于磷酸肽富集的蛋白质组学方法分析发现大量布氏锥虫的磷酸化位点，包括在血流型(bloodstream form,BSF)布氏锥虫细胞质蛋白一小部分的丝氨酸、苏氨酸以及酪氨酸的磷酸化位点。基于852个特异的磷酸肽和1024个磷酸化位点，识别了491种磷酸蛋白质。真核生物的蛋白质激酶催化的磷酸化反应，在真核细胞中是最需要研究的翻译后修饰，因为磷酸化调节几乎存在于所有的细胞过程。在这491种蛋白质中发现丝氨酸和苏氨酸残基都发生磷酸化，但基因组中缺乏保守的酪氨酸激酶，可是存在一些磷酸化的酪氨酸残基[6]。在182种蛋白质激酶种，布氏锥虫的激酶补体比其他细胞或寄生虫多了一倍以上，表明可逆的蛋白质磷酸化所产生的细胞信号已经演变成了一种精密且主导的成分[7]。

酪氨酸磷酸化在生物体中是一个相对富集的翻译后修饰，但其缺乏酪氨酸激酶。应用磷酸酪氨酸特异性蛋白质组学方法从原环型(procyclic form,PCF)布氏锥虫全细胞提取物中鉴定了 34 种含磷酸酪氨酸的蛋白质，用抗磷酸酪氨酸抗体的免疫荧光显微镜检查发现，有细胞骨架结构(基体和鞭毛)和寄生虫核仁相关的酪氨酸磷酸化蛋白浓度的存在。也证实了酪氨酸磷酸化蛋白的这种定位支持信号分子的功能受其在布氏锥虫中的精确定位的观点。同时通过免疫荧光显微镜对布氏锥虫两个生命周期阶段酪氨酸磷酸化蛋白定位进行研究，发现携带这种翻译后修饰的蛋白质都集中于细胞骨架上，特别是轴丝和鞭毛基体。之前也有一项对绿藻莱茵衣藻的研究表明，酪氨酸磷酸化的糖原合酶激酶3(glycogen synthase 3 kinase,GSK3)活性形式在鞭毛中富集[8]。莱茵衣藻 GSK3 的 RNA 干扰导致细胞没有鞭毛，这表明 GSK3 在鞭毛的组成和维持中发挥作用，并且酪氨酸磷酸化蛋白与鞭毛和基体相关[9]。

Urbaniak MD通过BSF和PCF布氏锥虫的全局定量磷酸化蛋白质组学研究，使用每个生命周期阶段的细胞培养中氨基酸稳定同位素标记，识别了9314个以前未识别的磷酸化位点，发现磷酸化的变化与蛋白质丰度的变化呈负相关，磷酸化化学计量在生命周期阶段之间保持不变。蛋白质丰度主要保持不变，但磷酸化化学计量变化显著，同一蛋白质上的不同磷酸化位点显示出广泛变化。这些数据表明，差异磷酸化广泛存在于PCF和BSF之间，并且对蛋白质组的变化具有显著的复杂性。布氏锥虫生命周期阶段之间蛋白质磷酸化状态的变化也为蛋白质组的差异表达增加了显着的复杂性[10]。

1.1.2 乙酰化修饰 赖氨酸乙酰化是发生在该残基的Nε-氨基链上添加一个乙酰基团，消除了其正电荷。在Ariely的试验中，通过免疫印迹和蛋白质沉淀等方法，分析BSF和PCF布氏锥虫中不同的乙酰化特征。研究发现，与主要能量来源是糖酵解的血流型布氏锥虫比起来，糖酵解酶在昆虫中发育并利用氧化磷酸化来获得能量的PCF布氏锥虫的乙酰化程度更高[11]。

试验还研究了乙酰化是否调节布氏锥虫果糖-1,6-二磷酸醛缩酶，发现在没有葡萄糖的情况下培养的PCF寄生虫中醛缩酶活性降低，并通过体外去乙酰作用部分恢复；在富含葡萄糖的培养基中培养的PCF蛋白提取物的乙酰化导致醛缩酶活性降低。此外，与在葡萄糖存在下培养的那些虫体相比，没有葡萄糖的情况下培养的PCF中的醛缩酶乙酰化水平更高。为了进一步证实乙酰化的作用，在重组布氏锥虫醛缩酶的催化位点附近，赖氨酸残基被谷氨酰胺取代。这些谷氨酰胺，尤其是K157，作为醛缩酶活性的关键性残基，抑制了醛缩酶的活性，改变了静电表面电位，降低了底物的结合能力并改变了酶的催化结构。试验证实了乙酰化在调节布氏锥虫糖酵解途径中的酶活性中的作用，以及对寄生虫代谢的重要性[11]。

组蛋白乙酰化和H2A变体似乎存在于几乎所有含有组蛋白的生物体中，并且在调节RNA聚合酶Ⅱ转录方面具有高度保守的作用。Kraus等研究通过定量质谱法发现，布氏锥虫蛋白转录起始位点-核小体高度乙酰化，同时H4和H2A.Z被HAT2和HAT1乙酰化。HAT2的消耗导致转录起始位点相关H4乙酰化水平降低，影响了H2A.Z沉积和转录起始位点。相比之下，HAT1的消耗导致H2A.Z和H2B.V乙酰化水平降低，对H2A.Z沉积的影响很小，但使得转录水平有很大降低[12]，表明H4或H2A.Z乙酰化修饰在H2A.Z沉积和RNA转录起到不同作用。

1.1.3 泛素化修饰 翻译后修饰还包括泛素化以及泛素样修饰物[13]，泛素样修饰物可以对许多细胞进行调节，包括细胞周期、转录、应激、DNA损伤修复、细胞信号转导、核转运和自噬等过程[14]。Ubl家族有神经前体细胞表达发育下调8(neural precursor cell-expressed developmentally downregulated 8,NEDD8)、小泛素相关修饰物(small ubiquitin-related modifier,SUMO)、泛素折叠修饰物1、泛素相关修饰物1、自噬相关蛋白8和自噬相关蛋白12、干扰素刺激基因 15和人类白细胞抗原-F 相邻转录物 10。其中SUMO已经在鞭毛原生寄生虫中得到广泛的研究，尤其是布氏锥虫和克氏锥虫[15]。

在布氏锥虫中，基于45种蛋白质已鉴定出53个SUMO的受体位点[16]。使PCF布氏锥虫增殖前的SUMO沉默会导致虫体生长抑制、G2/M期有丝分裂停滞及无法正确分离染色体的情况。BSF布氏锥虫中SUMO的敲除导致了多核细胞的生长停止和积累。虽然其他的生物在染色体分离依赖DNA拓扑异构酶Ⅱ的SUMO化修饰，但还没有证据证明布氏锥虫相关同源物受SUMO调节。而在缺乏SUMO的BSF布氏锥虫中，布氏锥虫拓扑异构酶Ⅱ的着丝粒定位切割活性却保持完整，这解释了为什么核分裂仍在这些突变体中进行。这些数据表明 SUMO 在布氏锥虫的整个生活史中具有不同的底物和功能。

在直径约为2 μm的布氏锥虫表面，覆有一层厚度为12 nm～15 nm的VSG (variant surface glycoproteins,VSG)，占锥虫总蛋白的10%[17]，寄生虫自发地转换其VSG，这个过程称为抗原变异，目的是逃避宿主免疫反应，这也是锥虫病在非洲流行多年的原因之一。布氏锥虫VSG的表达和功能也受多种泛素化途径的控制。布氏锥虫SUMO共轭物在细胞核中的富集，是VSG表达位点(VSG expression site,VSG-ES)所独有的，涉及到VSG-ES启动子上游的染色质区域。TbSIZ1/PIAS1被鉴定为SUMO E3连接酶，它介导TbSUMO与VSG-ES染色质的结合，通过集合RNA聚合酶Ⅰ导致其转录激活[18]。

布氏锥虫NEDD8可以在整个细胞质中找到，但它却在细胞核和鞭毛中富集。在NEDD8缺失的布氏锥虫中，出现了鞭毛脱离和有丝分裂缺陷的现象，同时出现有丝分裂和有丝分裂后细胞中DNA的异常重新复制。研究结果表明，这种Ubl对锥虫细胞核和鞭毛具有重要的作用，并且调节了布氏锥虫的细胞周期进程[19]。

2 布氏锥虫组蛋白翻译后修饰

与其他的真核生物不同，锥虫在其组蛋白中保留了一个保守的特征——组蛋白及其翻译后修饰高度保守。组蛋白的PTMs对布氏锥虫有较大的影响，可能会导致其细胞或器官的活动发生有关变化，锥虫中组蛋白PTMs的多样性揭示了在组蛋白功能调节中的动态作用。组蛋白上氨基酸的甲基化、磷酸化以及乙酰化若出现改变，将会导致整个细胞的周期进程发生变化。

除了VSG表达外，锥虫中的几个生物过程也涉及了组蛋白PTMs。已有研究发现H3K76二甲基化和三甲基化以及相关的组蛋白甲基转移酶DOT1A和DOT1B。组蛋白的甲基化在锥虫DNA复制和细胞周期的进程中发挥作用，并且观察到H3K76的缺失会导致布氏锥虫的细胞周期缺陷[20]。进一步的研究表明，在DNA没有完成合成的情况下，DOT1A的消耗会导致细胞进行核分裂，而DOT1A的过度表达会与持续合成的DNA相结合，从而导致非整倍性[21]，布氏锥虫组蛋白去乙酰化酶SIR2相关蛋白的过度表达导致对DNA损伤剂的敏感性增加。

在动基体目中，布氏锥虫也是唯一有DNA甲基化修饰的物种[22]。与其他真核生物相似，布氏锥虫的核小体也都是由核心组蛋白H2A、H2B、H3、H4以及对应的变体组成，但进行序列比对时，布氏锥虫与高等真核生物组蛋白相比，C端相对保守，N端差异较大，尤其是H2A和H2B。H2A的C端有过度乙酰化的趋势，H2A、H2B和H4的N端处的丙氨酸存在单甲基化位点。

3 锥虫PTMs与相关功能联系

3.1 蛋白质PTMs与锥虫的运动适应性

鞭毛蛋白PTM组的变异可以反映出寄生虫之间运动能力的差异。锥虫鞭毛包含一个典型的9+2微管轴丝，旁鞭毛杆沿着该轴丝运行[23]。轴丝从基底体发出，并通过鞭毛附着区与细胞膜横向连接。伊氏锥虫鞭毛每个部分的大多数蛋白质在伊氏锥虫中被高度修饰或完全修饰，进而也解释了为什么与布氏锥虫相比，伊氏锥虫在受限的环境中具有更灵活的外观和更强的运动适应性[24]。内臂动力蛋白(IAD5-1,Tb927.7.920)在伊氏锥虫中高度表达，敲除后会导致细胞运动缺陷。IAD5-1的K1,134在布氏锥虫中被乙酰化，在伊氏锥虫中则被2-羟基异丁酰化。

3.2 蛋白质PTMs与锥虫的能量代谢和特异性氧化还原

糖酵解途径是锥虫主要的能量代谢途径[25]，其中参与的酶大部分都有多重修饰，其中8个PTMs在糖酵解途径中显著富集。在伊氏锥虫和布氏锥虫糖酵解的过程中最普遍的是发生在3种限速酶上的乙酰化和 2-羟基异丁酰化。此外，还观察到许多 PTMs出现在酶的关键残基处。例如，1,6-二磷酸果糖醛缩酶的K117可以被6种类型的PTM修饰，烯醇化酶的N338被N-糖基化。

作为早期分支的真核生物，锥虫已经以一种独特的基于色氨硫酮的硫醇氧化还原体系的方式进化[26]。色氨硫酮还原酶被认为是抗锥虫病药物的靶点，可将色氨硫酮二硫化物再循环回二氢色氨硫酮，并且锥虫毒素(TXN)催化电子从二氢色氨硫酮转移到不同的蛋白质靶标，这些靶标通常涉及多种功能，例如细胞增殖和抗氧化防御的能力。已发现多个与TryS相关的PTM，TryR和TXN以及TXN1和TXN2在布氏锥虫中的表达高于伊氏锥虫。

3.3 蛋白质PTMs与布氏锥虫VSG

布氏锥虫VSG的表达和功能也受多种泛素化途径的控制，已鉴定了491个布氏锥虫蛋白质上的1204个磷酸化位点，并使用抗磷酸酪氨酸抗体鉴定了PCF布氏锥虫中的34个磷酸化酪氨酸位点。另一项研究报告了布氏锥虫阶段特定的磷酸化变化，并表明差异磷酸化在PCF布氏锥虫和BSF布氏锥虫之间普遍存在。在最近的实验中检测到PCF布氏锥虫的210种蛋白质中有288个赖氨酸乙酰化位点，在BSF的285种蛋白质中检测到380个位点，尤其是大多数赖氨酸乙酰化(K-ac) 蛋白在代谢过程中富集，表明它们对寄主的寄生虫适应至关重要[27]。这些检测结果进一步解释了锥虫生长的调控机制以及锥虫病的发病机制，说明参与蛋白质修饰和去修饰的分子是生物制药发展的重要目标。

4 展望

布氏锥虫缺乏转录调节因子，生活史中主要依靠蛋白质翻译和翻译后修饰对细胞功能进行相关调节，研究不同种类的修饰对布氏锥虫功能的影响是有必要的。目前已对蛋白PTMs进行了广泛的分类，但关于其功能意义的研究还有大部分空白需要填补。锥虫表观遗传学的研究在近几年有广泛扩大的趋势，尤其是组蛋白的翻译后修饰，作为锥虫遗传信息的第二媒介，起到调控基因转录的作用。理解蛋白质各种修饰的功能意义以及调控机制，有利于对锥虫相关生理功能以及针对其生物药物靶点的研究奠定理论基础。

为了研究各种修饰的功能和意义，可以通过敲除相关变体以及高分辨率质谱等方法进行研究和检测，分析修饰对虫体功能、表型等的影响。同时还可对不同种类的锥虫样本进行定量蛋白质组学分析、免疫印迹、免疫沉淀等试验，分析相关修饰位点和修饰特征，绘制PTM组学图谱，通过研究不同修饰所造成的相关影响，进而推断这些修饰进行了何种的调节以及何种程度的调节，以便深入推进对支持布氏锥虫生活史和过程的生物学机制的了解、锥虫重要药物靶点的研究以及抗锥虫药物的研发。