实验教学中对魏曦氏细菌鞭毛染色技术的改良探索

张玮 杨风琴 廖国玲

作者单位：750004 银川，宁夏医科大学临床医学院

鞭毛是细菌的特殊结构和运动器官，与细菌致病力密切相关。通过观察细菌菌体有无鞭毛以及鞭毛在菌体的位置和数量，可鉴定和鉴别细菌。由于鞭毛非常细小，在一般光学显微镜下不易观察其形状和数目等，给细菌分类鉴定和教学工作带来诸多不便。此时需借助特殊染色方法加粗鞭毛，使鞭毛可在光学显微镜下被观察到［1］。然而鞭毛的染色过程繁琐、技术性强、染色步骤较严格，且传统方法诱导鞭毛时间长，初学者不易掌握。本教研室在过去研究基础上，经反复实践摸索出一种鞭毛改进染色法，能在较短时间内获得较好的染色效果。本文以变形杆菌作为试验对象，对传统经典的魏曦氏鞭毛染液配方、细菌的培养基种类和培养时间进行探索，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 菌种 普通变形杆菌、伤寒杆菌为本实验室保存的菌种，经鉴定均符合自身细菌生物学特性。

1.2 培养基 营养琼脂（批号：20170911）、克氏双糖含铁培养基（批号：20180109）和半固体培养基（批号：20180509）均购自北京路桥技术股份有限公司；血琼脂基础培养基（批号：201902）购自英国OXOID 公司。

1.3 染料及试剂 硫酸铝钾（批号：20171011）和鞣酸（批号：20170105）均购自天津市盛奥化学试剂有限公司；石炭酸（批号：20170315）购自天津市化学试剂三厂；碱性复红（批号：20170805）购自上海士锋生物科技有限公司。

1.4 仪器 压力蒸汽灭菌器（YXQ-LS-50A）购自上海博讯有限公司；电热恒温培养箱（DH6000BII）和数码生物显微镜（BK5000 Series）均购自重庆奥特有限公司。

1.5 检测方法

1.5.1 载玻片处理 将玻片置于肥皂水中煮沸5～10 min，用自来水冲洗后在洗涤液中浸泡0.5～2 h，再用自来水流水冲洗3 h 以上，待干燥后浸于95%乙醇中备用［2］。

1.5.2 改良魏曦氏鞭毛染液配制 A 液：媒染液［3］200 g/L，鞣酸2 mL，饱和硫酸铝钾2 mL；B 液：石炭酸复红6 mL。在使用前1 周将A 液和B 液按4：6 的比例混合过滤，作为染色应用液备用。

1.5.3 菌种培养及制片 将普通变形杆菌和伤寒杆菌于肉汤培养基中复苏，在营养琼脂培养基上连续传代2 次，再分别接种于半固体培养基、营养琼脂、血琼脂和克氏双糖含铁培养基，每种培养基分别接种3 个，35 ℃分别培养10 h、15 h、20 h。取洁净玻片置于平台，将新制蒸馏水滴在玻片上，挑选培养好的菌落或菌苔边缘部分，在水膜上轻轻接触一下，使细菌均匀扩散，避免搅动，以防细菌鞭毛脱落。自然干燥或置35 ℃温箱干燥。

1.5.4 鞭毛染色 将制备好的普通变形杆菌和伤寒杆菌涂片置于染色架上，滴加改良鞭毛染色应用液染色3～5 min，用蒸馏水缓慢冲洗后晾干镜检。菌体和鞭毛均为红色，若染色时间长则鞭毛粗，若染色时间短则鞭毛细。

2 结果

经改良鞭毛染色后的菌体完整，易着色，视野清晰，无沉淀颗粒；鞭毛染色以及完整性和伸展性均较好、粗细适中。

在各培养基上培养10 h 后培养物的鞭毛染色情况：有鞭毛的细菌数量较多，无鞭毛脱落。见图1。

图1 培养10 h 鞭毛魏曦氏改良染色情况（油镜×100）

培养15 h 后培养物的鞭毛染色情况：60%细菌有鞭毛。见图2。

图2 培养15 h 鞭毛魏曦氏改良染色情况（油镜×100）

培养20 h 后培养物的鞭毛染色情况：20%细菌有鞭毛，尤其是克氏双糖含铁培养基上有鞭毛的细菌更少。见图3。

图3 培养20 h 鞭毛魏曦氏改良染色情况（油镜×100）

3 讨论

魏曦氏鞭毛染色原配方A 液中的石炭酸与碱性复红乙醇饱和液相遇可发生染料沉淀，导致染料有效成分减少，从而影响染色效果。改良染色配方将原配方A 液中的石炭酸去掉，仅用鞣酸和饱和硫酸铝钾；将原配方B 液中的碱性复红乙醇饱和液换成石炭酸复红，避免了上述情况的发生。经改良的A 液与B 液相遇后出现的沉淀减少。另外，原配方中A 液与B 液按1：9 的比例配制，复红染料所占比例较大，两者混合可出现染料沉渣，导致染色背景脏，不利于鞭毛的观察。而改良染色配方将A 液与B 液按4：6 的比例配制，减少了染料沉渣的出现。

传统魏曦氏鞭毛染色法需要先将有鞭毛的细菌在液体培养基中连续转种7 代，对鞭毛进行诱导，才能染出满意的鞭毛［4］。然而经过实验教学反复实践我们发现，仅需将细菌复苏至第2 代，之后转种于常用的半固体培养基、血琼脂、营养琼脂和克氏双糖含铁培养基上，在分离培养鉴定的同时直接取上述培养物进行鞭毛染色，染色后的鞭毛就已清晰可见，且颜色较深，从而简化了操作步骤，节省了操作时间。

细菌鞭毛除了与合适的营养条件和培养温度有关外，还与培养时间有关。经查阅文献发现，大多数研究报道的培养时间为10～24 h［5-6］。本试验设置了10、15、20 h 3 个培养时间段，取各自时间段的培养物进行鞭毛染色，培养10 h后鞭毛数量多、粗细均匀、着色深；15 h 后有鞭毛的细菌占60%；20 h 后有鞭毛的细菌仅占20%。由此证实，细菌鞭毛染色应选择10 h 培养物，此时细菌生长最旺盛，鞭毛正处于壮年期，鞭毛过长则菌体趋向衰老，鞭毛脱落则不易观察到鞭毛［4，7］。

综上所述，使用改良魏曦氏鞭毛染液配方以及4 种常用培养基的10 h 培养物进行鞭毛染色，鞭毛染色效果好，操作简单方便，成功率高，具有较好的使用价值。