砂烫附片炮制前后的质量属性变化研究

张钰明，谭佳威，洪婷婷，杨琳洁，刘蕾蕾，刘冬涵，杜守颖 ，白 洁，陆 洋

（北京中医药大学 中药学院 , 北京 102488)

附子始载于《神农本草经》，是毛茛科植物乌头Aconitum carmichaelii Debx.子根的加工品，为有毒之品。生附子中的乌头碱类是有效成分，同时也是毒性成分，需要经过炮制后才能在临床使用。在古籍中涉及到生附子的炮制方法有很多，演变至清代已有70 多种制法[1]。追溯到张仲景的《伤寒杂病论》：“皆破解，不咀，或炮或生，皆去黑皮，刀刲取里白者，故曰中白”，是关于附子炮制的最早记载。汉代首创火炮，炮熟性缓而补阳，且能减弱其毒性[2]。长期实践验证，炮附子毒性低、疗效好、作用缓和，长于温肾助阳、回阳救逆，为其它炮制品所不能替代[3]。

从古代文献来看，“凡用附子、乌头、天雄，皆热灰微炮令坼，勿过焦[4]”。火炮法又分为古代干热法、清炒法、烘烤法和砂烫法[5]。这四种制法均秉承了张仲景的学术思想，但从炮制后的效果和制备过程来看，古代的干热法和清炒法炮制程度较难掌控，容易内焦外生，质量不均一，砂烫法与现代烘烤法可达到内外皆黄和质地酥脆的炮制要求；但考虑到现代烘烤法由于不同位置烘烤不均匀容易导致炮附子的差异较大，对控温设备的要求较高，且饮片烘烤后质地不如砂烫法酥脆，因此本实验研究砂烫法对附子质量的影响。

因附子的采收期是6 月下旬至8 月上旬，附子不易保存，鲜附子切片后更易干燥，以防发霉变质；再加之砂烫附子无法观察其炮制程度，操作不便，难度系数加大，因此最终采用经产地加工（切片处理）的生附片进行砂烫。在临床应用中附片多以汤剂形式入药，故本实验建立了附片水煎液的特征图谱方法，并采用HPLC 来测定附片中生物碱的含量，从生物碱的含量、特征图谱、出膏率三个方面分析炮制前后的附片的质量属性，为其后期的毒性控制提供了依据。

1 材料

1.1 仪器

DHG-9140A 型电热恒温鼓风干燥器（上海一恒科技有限公司）；RE-52AA 型金叶牌旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；Thermo Fisher U3000 型高效液相色谱仪[赛默飞世尔科技（中国）有限公司]。

1.2 试药与试剂

苯甲酰新乌头原碱对照品（批号：111795-201604）、苯甲酰乌头原碱对照品（批号：111794-201705）、苯甲酰次乌头原碱对照品（批号：111796-201705)；新乌头碱对照品（批号：DST191015-025）、乌头碱对照品（批号：DST200330-006)、次乌头碱对照品（批号：DST200318-058）均购自德思特生物科技有限公司。生附片药材（由神威药业集团有限公司提供）。乙腈、甲醇、磷酸（Fisher 公司，色谱级），甲酸（天津市大茂化学试剂厂，色谱级），纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司），其它试剂为分析级。

附片药材采自陕西汉中、四川江油、陕西安州，经北京中医药大学刘春生教授鉴定为毛茛科植物乌头Aconitum carmichaelii Debx.子根的加工品。

2 方法

2.1 砂烫附片的制备

将电陶炉调至2 200 W，热锅，用红外线测温仪测锅边与锅底的温度，均达到200 ℃时，投入 10倍量洁净河砂，当砂温达到 250 ℃时，将功率调至1 400 W（约240 ℃），投入大小分档的生附片 100 g，不断翻炒，至饮片内外皆黄，且表面出现裂隙时取出。

2.2 附片中生物碱含量测定方法的建立

2.2.1 色谱条件的建立 色谱柱Shiseido Capcell PAK C18MG S-5（4.6 mm × 250 mm）；流动相为乙腈（A）-40 mmol/L（B）醋酸铵溶液（加氨水调pH 约至9.5），洗脱梯度见表1；检测波长为240 nm；柱温为35 ℃；流速为1.0 mL/min；进样体积为10 μL；生附片、砂烫附片与对照品的图谱见图1。

表1 附片中生物碱含量测定的洗脱梯度Tab. 1 Elution gradients of alkaloid content determination in aconite slices

图1 生附片与砂烫附片中生物碱含测的HPLC 图谱Fig. 1 Mapping of raw and sanded aconite slices

2.2.2 对照品溶液的制备 分别精密称取苯甲酰新乌头原碱5.03 mg，苯甲酰乌头原碱5.02 mg，苯甲酰次乌头原碱5.02 mg 三种单酯型生物碱至25 mL容量瓶中，加异丙醇-二氯甲烷定容，摇匀后，精密吸取0.5 mL 溶液至10 mL 容量瓶中，加异丙醇-二氯甲烷定容，即得。分别精密称取新乌头碱12.66 mg，乌头碱12.57 mg，次乌头碱12.57 mg 三种双酯型生物碱至10 mL 容量瓶中，加异丙醇-二氯甲烷定容，摇匀后，精密吸取1 mL 溶液至10 mL容量瓶中，加异丙醇-二氯甲烷定容，摇匀后，再精密吸取1 mL 溶液至25 mL 容量瓶中，加异丙醇-二氯甲烷定容，即得。再分别称取六种生物碱对照品适量至容量瓶中，加甲醇溶解后，作为用来定性的混合对照品溶液（浓度约1 mg/mL）。

2.2.3 供试品溶液的制备 取砂烫附片粉末（过三号筛）约2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加氨试液3 mL，精密加入异丙醇-乙酸乙酯（1 ∶1）混合溶液50 mL，称定重量，超声处理（功率：300 W，频率：40 kHz，水温在25 ℃以下）30 min，放冷，补重，摇匀，滤过。精密移取续滤液25 mL，40 ℃以下减压回收溶剂至干，残渣精密加入异丙醇-二氯甲烷（1 ∶1）混合溶液3 mL，滤过，取续滤液，即得[6]。

2.3 附片水煎液特征图谱的建立

2.3.1 色谱条件的建立 色谱柱Thermo AcclaimTM 120-C18（4.6 mm × 250 mm，5 μm）；流动相为乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），洗脱梯度见表2；检测波长为230 nm；柱温为30 ℃；流速为1.0 mL/min；进样体积为20 μL。生附片水煎液和砂烫附片水煎液的特征图谱见图2。

表2 附片水煎液特征图谱的流动相洗脱梯度Tab. 2 Elution gradient of mobile phase in characteristic map of aconite slices decoction

图2 生附片水煎液和砂烫附片水煎液的特征图谱Fig. 2 Characteristic maps of the water decoction of raw and sanded aconite slices

2.3.2 供试品溶液的制备 将生附片、砂烫附片分别切成规格基本相同的片或小块，精密称取各药材2.5 g 于250 mL 圆底烧瓶中，精密加入100 mL 水，加热回流70 min，过滤后放冷，调整体积至100 mL。精密移取1 mL 续滤液，稀释1 倍，将稀释水溶液离心后（10 000 r/min，5 min），取上清液滤过，即得。

2.3.3 特征图谱处理方法 将图谱数据以cdf.的格式导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”软件，对前11 min 的色谱峰进行剪切，设置时间窗宽度为0.1、以保留时间为30.8 min 的峰为参照，进行峰匹配，计算相似度结果。

2.3.4 方法学考察 取供试品溶液按“2.3.1”项下色谱条件连续进样6 次，按照“2.3.3”项处理，结果相似度R 均大于0.98，说明该仪器精密度良好；取同一批样品，按“2.3.2”项下方法平行制备6 份供试品溶液，按“2.3.1”项下色谱条件测定，按照“2.3.3”处理，结果相似度R 均大于0.98，说明该方法重复性良好；取供试品溶液放置 0、3、6、9、12、24 h后按“2.3.1”项下色谱条件测定，按照“2.3.3”处理，结果相似度R 均大于0.98，说明测定的样品在24 h内保持稳定。

2.4 统计学方法

用SAS 8.2 软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用独立样本t 检验，多组间比较采用方差分析，多组间两两比较采用LSD 检验。以P ＜0.05 为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 附片中生物碱含量测定

按照“2.3.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件，以随行标品作对照，分别测定生附片和砂烫附片中三种单酯型生物碱、三种双酯型生物碱的含量。附片炮制前后三种单酯型生物碱含量见表3。由表3 可知，生附片三种单酯型生物碱含量平均值均小于砂烫附片含量平均值，差异具有统计学意义（P ＜0.05），单酯型生物碱是附片中的有效成分，因此可说明砂烫有增效的作用。

生附片与砂烫附片中双酯型生物碱的含量测定结果如表4 所示，生附片双酯型生物碱的含量均高于砂烫附片含量平均值，差异具有统计学意义（P ＜0.05），可能是由于炮制后双酯型生物碱被破坏的原因。由于双酯型生物碱为毒性成分，因此可说明砂烫能减毒。

3.2 附片水煎液特征图谱的测定

分别吸取三个产地附片生品、炮制品供试品溶液适量，按“2.3.1”项下色谱条件测定，按照“2.3.3”项处理，根据多批次样品色谱图的共有模式生成生品对照图谱与炮制品对照图谱，计算三个产地各批次附片特征图谱与对照图谱的相似度并计算均值，结果见表5，生附片和砂烫附片的相似度均大于0.80。三个产地附片炮制前后的特征图谱没有显著性差异（P ＞0.05），说明炮制对其影响不大。三个产地生附片间的特征图谱也无显著性差异（P ＞0.05），说明均一性较好。

3.3 附片出膏率的测定

取“2.3.2 ”项下剩余的供试品溶液，加热浓缩成稠膏状，60 ℃减压干燥至恒重，称定干膏重量，按出膏率=干膏重/取样量×100%计算。结果见表6，从表中看出，同一产地的生附片、砂烫附片出膏率值都较为接近，差异无统计学意义（P ＞0.05），说明炮制对出膏率影响不大。三个产地生附片间的出膏率比较，以及三个产地砂烫附片间的出膏率比较，均无显著性差异（P ＞0.05），说明这三个产地的砂烫附片的出膏率均一性较好。

表3 生附片与砂烫附片中单酯型生物碱的含量测定结果（±s）Tab. 3 Content determination results of monoester alkaloids of raw and sanded aconite slices （±s）

表3 生附片与砂烫附片中单酯型生物碱的含量测定结果（±s）Tab. 3 Content determination results of monoester alkaloids of raw and sanded aconite slices （±s）

d±sd 配对t P陕西汉中 4 苯甲酰新乌头原碱/% 0.012 9 ± 0.003 1 0.029 6 ± 0.007 3 0.016 7 ± 0.006 1 -7.78 0.000 1苯甲酰乌头原碱/% 0.001 8 ± 0.000 6 0.005 5 ± 0.002 8 0.003 7 ± 0.003 3 -3.16 0.015 8苯甲酰次乌头原碱/% 0.000 6 ± 0.000 4 0.006 6 ± 0.002 5 0.006 0 ± 0.002 7 -6.26 0.000 4总含量/% 0.015 3 ± 0.002 8 0.041 7 ± 0.012 1 0.026 4 ± 0.010 9 -6.84 0.000 2四川江油 6 苯甲酰新乌头原碱/% 0.011 1 ± 0.002 8 0.020 5 ± 0.017 5 0.009 3 ± 0.014 6 -2.20 0.049 7苯甲酰乌头原碱/% 0.003 2 ± 0.001 9 0.008 9 ± 0.001 7 0.005 6 ± 0.002 4 -8.07 0.000 1苯甲酰次乌头原碱/% 0.002 3 ± 0.000 3 0.009 6 ± 0.002 6 0.007 3 ± 0.002 8 -9.03 0.000 1总含量/% 0.016 7 ± 0.004 6 0.039 0 ± 0.016 2 0.022 2 ± 0.016 2 -4.76 0.000 6陕西安州 5 苯甲酰新乌头原碱/% 0.018 5 ± 0.005 9 0.051 7 ± 0.019 4 0.033 1 ± 0.024 2 -4.34 0.001 0苯甲酰乌头原碱/% 0.002 0 ± 0.000 7 0.010 5 ± 0.003 7 0.008 5 ± 0.004 0 -6.67 0.000 1苯甲酰次乌头原碱/% 0.003 1 ± 0.001 0 0.011 4 ± 0.003 8 0.008 3 ± 0.003 7 -7.14 0.000 1总含量/% 0.023 6 ± 0.006 0 0.073 6 ± 0.020 4 0.050 0 ± 0.025 9 -6.11 0.000 2产地 n 类别 生附片 砂烫附片

表4 生附片与砂烫附片中双酯型生物碱的含量测定结果（±s）Tab. 4 Content determination results of diester alkaloids of raw and sanded aconite slices（±s）

表4 生附片与砂烫附片中双酯型生物碱的含量测定结果（±s）Tab. 4 Content determination results of diester alkaloids of raw and sanded aconite slices（±s）

d±sd 配对t P陕西汉中 4 新乌头碱/% 0.058 0 ± 0.028 1 0.000 2 ± 0.000 3 0.057 8 ± 0.028 3 5.77 0.000 7乌头碱/% 0.010 6 ± 0.006 4 0.000 0 ± 0.000 0 0.015 4 ± 0.006 4 4.71 0.002 2次乌头碱/% 0.027 4 ± 0.005 8 0.001 0 ± 0.000 6 0.026 4 ± 0.005 4 13.82 0.000 1总含量/% 0.096 0 ± 0.037 4 0.001 2 ± 0.000 8 0.038 2 ± 0.010 3 7.14 0.000 2四川江油 6 新乌头碱/% 0.039 5 ± 0.010 5 0.000 0 ± 0.000 0 0.039 5 ± 0.010 5 13.02 0.000 1乌头碱/% 0.015 4 ± 0.005 8 0.000 1 ± 0.000 2 0.015 4 ± 0.005 8 9.25 0.000 1次乌头碱/% 0.030 0 ± 0.009 8 0.007 8 ± 0.009 2 0.022 3 ± 0.006 9 11.17 0.000 1总含量/% 0.085 0 ± 0.020 5 0.007 8 ± 0.009 2 0.045 5 ± 0.011 1 15.91 0.000 1陕西安州 5 新乌头碱/% 0.024 3 ± 0.005 4 0.000 7 ± 0.000 6 0.023 5 ± 0.005 9 12.65 0.000 1乌头碱/% 0.004 5 ± 0.002 1 0.000 1 ± 0.000 1 0.004 4 ± 0.002 0 6.76 0.000 1次乌头碱/% 0.022 3 ± 0.007 9 0.0003 ± 0.0009 0.022 0 ± 0.007 7 9.04 0.000 1总含量/% 0.051 0 ± 0.001 8 0.0012 ± 0.0009 0.027 5 ± 0.006 6 87.97 0.000 1产地 n 类别 生附片 砂烫附片

表5 附片的特征图谱相似度结果（±s）Tab. 5 Similarity evaluation results of aconite slices（±s）

表5 附片的特征图谱相似度结果（±s）Tab. 5 Similarity evaluation results of aconite slices（±s）

产地 n 生附片 砂烫附片 t P陕西汉中 4 0.864 ± 0.04 0.859 ± 0.08 0.10 0.930 2四川江油 6 0.884 ± 0.05 0.859 ± 0.06 0.74 0.493 7陕西安州 5 0.910 ± 0.05 0.855 ± 0.08 1.85 0.137 3 F 1.48 0.01 0.266 3 0.990 8 P

表6 附片的出膏率结果（±s）Tab. 6 Paste yield results of aconite slice（±s）

表6 附片的出膏率结果（±s）Tab. 6 Paste yield results of aconite slice（±s）

产地 n 生附片 砂烫附片 t P陕西汉中 4 16.17 ± 0.68 17.13 ± 1.30 -1.52 0.225 2四川江油 6 17.66 ± 1.64 18.49 ± 2.03 -1.07 0.331 8陕西安州 5 18.28 ± 1.77 17.43 ± 1.92 0.75 0.497 2 F 2.25 0.78 0.147 5 0.478 6 P

3.4 附片炮制前后的质量属性变化分析

附子为有毒中药，其质量关系临床用药安全，因此炮制方法是否既能降低其毒性，又能增加其有效作用就显得十分重要。本研究采用HPLC 分别测定生附片和砂烫附片中的生物碱含量并运用统计学方法进行炮制前后的量值变化分析，结果显示经砂烫后单酯型生物碱含量显著提高，双酯型生物碱含量显著降低。分析其因炮制后双酯型生物碱中的新乌头碱、乌头碱、次乌头碱分别水解为单酯型生物碱中的苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱，双酯型生物碱完全被破坏，单酯型生物碱含量增加。双酯型生物碱是乌头类生物碱的大毒成分, 而单酯型生物碱毒性远低于双酯型生物碱，具有较好的药理作用，双酯型乌头碱类成分经水解转变单酯型乌头碱类成分, 毒性大大降低，因此砂烫附片可以减毒增效；通过建立附片水煎液特征图谱的方法来考察生附片、砂烫附片的水煎液特征图谱及出膏率，并运用统计学方法对炮制前后的特征图谱及出膏率进行比较，结果显示附片炮制前后的特征图谱无显著性差异，炮制前后的出膏率无显著性差异，说明炮制对附片的特征图谱及出膏率没有影响。

砂烫法炮制附片后质量属性较为稳定，炮制后起到减毒增效的作用。生附片到砂烫附片的量值变化关系中：特征图谱没有明显变化；出膏率没有明显变化；单酯型生物碱显著增加、双酯型生物碱显著减少。本次实验中使用的附片产地为四川省和陕西省，是附片的主产区，其含量符合《中国药典》标准，更增加了实验结果的可靠性。

4 讨论

4.1 砂烫法的温度确定

古书中记载以“内外皆黄”“坼”为炮附片外观性状标准。根据古书中的标准，以炮制后的色泽、性状、质地为指标，确定砂烫法炮制过程中的最合适温度。在实验室小试工艺中，通过控制加热功率调节砂烫法温度。在 2 200 W 功率下热锅，可快速达到200 ℃；在砂温达到 250 ℃时，用1 000 W（约223 ℃）需炮制5 min 左右，其断层内有白心且已经出现焦的趋势；用1 400 W（约240 ℃）炮制需4 ～ 4.5 min左右，其质地酥脆，内外皆黄，整体色泽匀称；用1 800 W （258 ℃）炮制时温度较高，难以把控火候，3.5 min 左右就有焦的趋势。通过对比不同温度炮制后的外观性状可以得出，当砂温达到 240 ℃，即电陶炉功率调至1 400 W 时，生附片炮制的效果最好，外观性状最接近古书中记载的标准。

4.2 砂烫附片与其它品种附片的差异性

2020 版《中国药典》收载了盐附子、黑顺片、白附片[6]。《中国药典》中的附子炮制品均采用胆巴或食盐炮制，它们都属于水制法。《四川省中药饮片炮制规范》收载有炒附片：“将中等细度的砂投入炒药机内，炒至滑利，投入生附片，砂炒至外表皮黄棕色，断面黄色，取出，迅速筛去砂子，晾凉[7]”，其规定“炒附片为不规则的片，厚2 ～ 5 mm，外表皮黄棕色，切面浅黄色至黄棕色，质松脆，气香，味微苦，微有麻舌感”。本实验在此标准的基础上，明确了砂烫附片具体的炮制参数。

在不同炮制品生物碱的含量比较中，《中国药典》中只有黑顺片的单酯型生物碱的总含量增加，而其它规格的炮制品反而无变化或有所下降。对其中的双酯型生物碱到单酯型生物碱的转化量进一步研究发现[8]：新乌头碱完全水解成醇胺类生物碱，无法转化为苯甲酰新乌头原碱，即转化率为0；乌头碱水解成苯甲酰乌头原碱的转化率最多为21.1%；次乌头碱水解成苯甲酰次乌头原碱的转化率最多为11.4%，而炒制法中相对应成分的转化率分别为31.3%、32.0%、46.1%，由此说明炒附片能降毒存效。这与本实验中的砂烫附片效果相同，均能增加单酯型生物碱含量，降低双酯型生物碱含量，起到降毒存效的作用。附子道地产区是四川，所以在地方炮制规范中有炒附片的记载，《四川省中药饮片炮制规范》中规定炒附片中单酯型生物碱的总含量应为0.010% ～0.130%，本实验中的砂烫附片均达到标准。

5 结论

本研究对附片的炮制方法进行研究，并建立了附片中生物碱成分的含量测定方法和水煎液的特征图谱。应用砂烫法进行炮制并从其炮制后的生物碱含量、水煎液特征图谱、出膏率三个方面进行质量属性的评价，同时分析附片炮制前后的量值变化关系，证明其炮制后质量属性稳定，起到了减毒增效的作用，对今后附片的毒性控制及临床研究有一定帮助，后期本实验还可以在此基础上继续进行附片药理学方面的研究来进一步佐证其质量属性与疗效的关系。