酶法合成麦芽糖醇脂肪酸单酯的抑菌性*

何志勇，王洁，曾茂茂，秦昉，陈洁

(江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡，214122)

脂肪酸酯不仅是一类优良的表面活性剂，还具有较好的防腐抗菌功能。目前国内外研究较多的主要是蔗糖酯类和甘油单脂肪酸酯类的抑菌性［1-5］，且研究发现，糖酯的酯化度会影响其抑菌性，蔗糖单酯的抑菌能力远远强于二酯或多酯［6］。麦芽糖醇脂肪酸酯是由麦芽糖醇与脂肪酸反应而成的一类新型优良的非离子型表面活性剂［7］，但有关其抗菌功能性质的研究较少。而且现有文献报道的大多是麦芽糖醇酯混合物的性质［8-9］，这样麦芽糖醇酯抑菌性与其化学结构和组成的关系就不是很清楚。因此，为了探讨不同脂肪酸酰基和不同亲水基团对糖酯抑菌性质的影响，本论文通过脂肪酶NOV435催化合成系列麦芽糖醇脂肪酸酯，经过分离纯化制备获得高纯度麦芽糖醇脂肪酸单酯产品，并重点研究不同单酯对细菌和酵母的抑菌性能，分析单酯结构与抑菌功能的关系，为其在食品工业中的进一步应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

固定化脂肪酶Novozym435购于丹麦诺维信公司;麦芽糖醇购于Roquette公司;4Å分子筛、柱层析硅胶(200～300目)，月桂酸、辛酸、油酸、硬脂酸、二甲基亚砜(DMSO)、正己烷、叔戊醇、异丙醇等均为分析纯，蛋白胨、牛肉膏、琼脂粉为生化试剂，均购于中国医药集团上海化学试剂公司;甲醇为色谱纯，购于百灵威;大肠杆菌(Eschericheae coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、解脂亚罗酵母(Yarrowia lipolytica)为江南大学食品学院提供;变异链球菌(Streptococcus mutans)购于上海信然生物化学有限公司。

SHZ-88台式水浴恒温振荡器，江苏太仓市实验设备厂;液相色谱串联四级杆飞行时间质谱仪(LCMS)、Waters1525高效液相色谱仪，美国Waters公司;自动部分收集器，上海沪西分析仪器厂;旋转蒸发仪，瑞士BUCHI公司;酶标仪，美国Molecular Devices公司;厌氧培养箱，英国Electrotek公司;无菌操作台，苏静集团安泰公司;振荡培养箱，常州国华电器有限公司;恒温培养箱，上海跃进医疗器械厂;灭菌锅，上海申安医疗器械厂;AVANCE III 400MHz核磁共振谱仪，德国Brucker公司。

1.2 实验方法

1.2.1 非水相酶法合成麦芽糖醇脂肪酸酯

取10 mmol麦芽糖醇、40 mmol脂肪酸(月桂酸、辛酸、油酸、硬脂酸)于250 mL具塞锥形瓶中，加入20 mL DMSO，50℃下平衡2 h，待完全溶解后，加入80 mL叔戊醇，50℃下平衡2 h，再加入1.0 g固定化脂肪酶Novozym435，反应12 h后加入6 g 4 Å分子筛，密封后放入50℃恒温水浴振荡(150 r/min)中反应72 h。其中油酸麦芽糖醇酯合成时需避光反应。

1.2.2 麦芽糖醇脂肪酸单酯的分离制备

将反应液用滤纸过滤除去固定化酶和分子筛，上硅胶柱层析分离。流动相分别为V(正己烷)∶V(异丙醇)∶V(甲醇)=4∶4∶2(月桂酸酯)，V(正己烷)∶V(异丙醇)∶V(甲醇)=3∶4∶3(辛酸酯)，V(正己烷)∶V(异丙醇)∶V(甲醇)=5∶3∶2(油酸酯)，V(正己烷)∶V(异丙醇)∶V(甲醇)=5∶4∶1(硬脂酸酯)，流速为 2 mL/min。洗出液经HPLC检测后，分段收集相应组分。色谱分析条件:色谱柱 Lichrospher C18(5 μm，4.6 mm ×250 mm)，流速1 mL/min，进样量20 μL，流动相分别为V(甲醇)∶V(水)=85∶15 溶液(月桂酸酯)，V(甲醇)∶V(水)=74∶26 溶液(辛酸酯)，V(甲醇)∶V(水)=96∶4溶液(油酸酯、硬脂酸酯)，柱温30℃，采用示差折光检测器，检测池温度30℃，检测器灵敏度为64。

将经过硅胶柱层析分离后的收集液蒸干，用色谱纯甲醇复溶，利用半制备HPLC制备。半制备条件:色谱柱 Lichrospher C18(5 μm，20.0 mm ×250 mm)，流速8 mL/min，进样量 500 μL，柱温 30 ℃，流动相同上。采用示差折光检测器，检测池温度30℃，灵敏度为64，分流比为1.5∶6.5。经半制备得到的馏出液蒸发掉有机溶剂，冻干备用。最终制备的产品分别经MS［10］、FT-IR［11］和 NMR［10］分析鉴定为纯度较高(＞95%)的麦芽糖醇月桂酸单酯、麦芽糖醇辛酸单酯、麦芽糖醇油酸单酯和麦芽糖醇硬脂酸单酯。

1.2.3 麦芽糖醇脂肪酸单酯的抑菌性

参照文献［12］的方法，配制营养肉汤(LB)培养基、营养(LB)琼脂培养基、酵母膏胨葡萄糖(YPD)琼脂培养基、TPY固体培养基、TPY液体培养基和酵母浸出粉胨葡萄糖培养基(YPD)。并将大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、变异链球菌和酵母菌接种到相应的培养基中进行菌种活化和扩大化培养。

将麦芽糖醇脂肪酸单酯纯品用无水乙醇配制成浓度为80 mg/mL的储存液(-20℃保存)，用相应培养基将储存液稀释成浓度为8 mg/mL，再依次2倍稀释，最终单酯浓度为0.062 5～6 mg/mL。

挑取斜面培养基上的大肠杆菌、枯草芽孢杆菌单菌落接种到LB液体培养基中，150 r/min 37℃振荡培养过夜;酵母菌接种到YPD液体培养基中，150 r/min 30℃振荡培养过夜;变异链球菌接种到TPY液体培养基中，37℃厌氧培养过夜。分别用生理盐水将过夜培养的菌液稀释至5×105CFU/mL作为初始菌液。取100 μL初始菌液置于96孔板上，加入100 μL不同浓度的各单酯溶液。以不添加单酯样品的作为阳性对照，不加入菌液的作为阴性对照。培养18 h后，用酶标仪测定600 nm下各孔的浊度(OD600)。相比OD阴性值，OD试验值几乎没有增长，则此时麦芽糖醇单酯的浓度即为最低抑菌浓度(MIC)，并计算抑菌率。

2 结果与讨论

2.1 麦芽糖醇脂肪酸单酯的分离制备

麦芽糖醇脂肪酸酯经酶法合成后，按各自硅胶柱分离条件反复分离纯化，收集单酯洗脱液，经HPLC分析，结果如图1所示，各洗脱液中不含脂肪酸，主要为2组单酯峰(1和2)，其中(a)为麦芽糖醇月桂酸单酯(7.8、8.3 min)，(b)为麦芽糖醇辛酸单酯(4.7、5.6 min)，(c)为麦芽糖醇油酸单酯(7.3、8.0 min)，(d)为麦芽糖醇硬脂酸单酯(7.6、8.3 min)。经MS分析，组分1和2为麦芽糖醇脂肪酸单酯的两种同分异构体。并利用半制备HPLC对麦芽糖醇脂肪酸单酯进一步纯化制备，获得足够量较纯的单酯产品，用于后续的抑菌性能测试。

2.2 麦芽糖醇脂肪酸单酯的抑菌效果

根据GB2760规定，通常商业蔗糖酯使用浓度一般为0.1% ～0.5%，部分情况下还会更高。因此，该抑菌实验中麦芽糖醇脂肪酸酯的质量浓度设定为0.062 5～6 mg/mL，以确保其在合适的使用量范围内。

图2为麦芽糖醇脂肪酸单酯对大肠杆菌的抑制效果。从图2可以看出，随着浓度增加，麦芽糖醇月桂酸单酯对大肠杆菌的抑制作用明显增强，当浓度为2.0 mg/mL时，即可达到完全抑制的效果;麦芽糖醇辛酸单酯和麦芽糖醇油酸单酯对大肠杆菌的抑制率增长相对比较缓慢，浓度为6.0 mg/mL时才能达到完全抑制;麦芽糖醇硬脂酸单酯对大肠杆菌的抑制能力稍差，6.0 mg/mL时抑菌率为75%。

麦芽糖醇脂肪酸单酯对枯草芽孢杆菌的抑制效果如图3所示，各测试样品均显示较强的抑制作用，当麦芽糖醇月桂酸单酯、麦芽糖醇辛酸单酯、麦芽糖醇油酸单酯和麦芽糖醇硬脂酸单酯质量浓度分别为0.5、4.0、6.0和6.0 mg/mL时就可完全抑制枯草芽孢杆菌的生长。

各麦芽糖醇脂肪酸单酯产品对变异链球菌也显示很强的抑制效果。由图4可知，麦芽糖醇月桂酸单酯、麦芽糖醇辛酸单酯、麦芽糖醇油酸单酯和麦芽糖醇硬脂酸单酯完全抑制变异链球菌生长的质量浓度分别为0.25、1.0、2.0 和 4.0 mg/mL。

图1 硅胶柱分离后麦芽糖醇脂肪酸单酯的HPLC图Fig.1 The HPLC of monoacyl maltitols separated by silica gel column，(a)monolauroyl maltitol;(b)mono octanoyl maltitol;(c)mono oleoyl maltitol;(d)mono stearoyl maltitol

图2 麦芽糖醇脂肪酸酯对大肠杆菌的抑菌效果Fig.2 Antibacterial effect of monoacyl maltitols on Eschericheae coli

图3 麦芽糖醇脂肪酸酯对枯草芽孢杆菌的抑菌效果Fig.3 Antibacterial effect of monoacyl maltitols on Bacillus subtilis

图4 麦芽糖醇脂肪酸酯对变异链球菌的抑菌效果Fig.4 Antibacterial effect of monoacyl maltitols on Streptococcus mutans

图5为麦芽糖醇脂肪酸单酯对解脂亚罗酵母的抑制效果。与抑制细菌效果比较，各单酯对酵母抑制作用相对较弱，浓度在6.0 mg/mL时，麦芽糖醇辛酸单酯、麦芽糖醇月桂酸单酯、麦芽糖醇油酸单酯和麦芽糖醇硬脂酸单酯对解脂亚罗酵母的抑制率分别为16.7%、29.3%、20.1%和10%以下。

综合以上结果并比较不同酰基链的麦芽糖醇单酯对各微生物的MIC值(表1)发现，麦芽糖醇月桂酸单酯对各试验菌均呈现最强的抑菌能力，麦芽糖醇辛酸单酯和麦芽糖醇油酸单酯次之，麦芽糖醇硬脂酸单酯抑菌作用最弱。另外，结果也显示，与蔗糖酯［1］类似，4种麦芽糖醇脂肪酸单酯对革兰氏阳性细菌的抑制能力要强于对革兰氏阴性细菌。

图5 麦芽糖醇脂肪酸酯对酵母菌的抑菌效果Fig.5 Antibacterial effect of monoacyl maltitols on Yarrowia lipolytica

表1 不同酰基链麦芽糖醇脂肪酸单酯对常见微生物的MIC值mg/mLTable 1 MIC of monoacyl maltitols with different fatty acid acyls

不同亲水基月桂酸单酯对微生物的MIC值见表2。麦芽糖醇月桂酸单酯对枯草芽孢杆菌和变异链球菌等革兰氏阳性菌的抑制作用明显强于麦芽糖月桂酸单酯和蔗糖月桂酸单酯，尤其是对变异链球菌显示了很强的抑制能力，有可能是由于相对麦芽糖和蔗糖而言麦芽糖醇本身对这类菌就有一定的抑制效果。而在对酵母菌抑制性能方面，麦芽糖和蔗糖基的月桂酸单酯要强于麦芽糖醇月桂酸单酯。

表2 不同亲水基月桂酸单酯对常见微生物的MIC值 mg/mLTable 2 MIC of mono lauroyl esters with different hydrophilic radicals

3 结论

通过脂肪酶NOV435催化合成并结合硅胶柱分离及半制备HPLC，获得了4种麦芽糖醇脂肪酸单酯产品，测试了其对不同细菌和酵母的抑制效果。结果表明，麦芽糖醇脂肪酸单酯对革兰氏阳性菌中枯草芽孢杆菌和变异链球菌具有很强的抑制效果，对革兰氏阴性菌中大肠杆菌有较好的抑制作用，对酵母菌抑制能力相对较弱。不同脂肪酸酰基对麦芽糖醇脂肪酸单酯抑菌性有一定影响，月桂酸单酯抑菌能力最强，辛酸单酯和油酸单酯次之，硬脂酸单酯较弱。与麦芽糖和蔗糖等亲水基月桂酸单酯相比，麦芽糖醇月桂酸单酯对枯草芽孢杆菌和变异链球菌有更强的抑制作用。综合而言，麦芽糖醇脂肪酸单酯具有优良的抑菌性能，在食品行业中将有很好的应用前景。

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