不同炮制工艺对附子生物碱类成分的影响

叶 强， 刘雨诗， 刘红梅， 刘娟汝， 唐雪梅， 郭 力∗

（1.成都中医药大学药学院，教育部中药材标准化重点实验室，中药资源系统研究与开发利用省部共建国家重点实验室培育基地，四川成都611137；2.江油市中医医院，四川江油621700）

附子Aconiti Lateralis Radix Praeparata为毛茛科植物乌头Aconitum carmichaelii Debx.子根的加工品［1］，始载于 《神农本草经》，具有回阳救逆、补火助阳、散寒止痛的功效。其味辛、甘、大热，有毒［2］，临床上常以其炮制品入药，目的是为了减毒增效［3-4］。附子的炮制历史悠久，炮制方法较多，涵盖炮、炙、浸、蒸、煮、烧、炒等70余种工艺［5-7］。2015年版 《中国药典》收载附子炮制品种包括盐附子、黑顺片、白附片、淡附片、炮附片［1］，均使用胆巴作为炮制辅料。胆巴本身具有一定毒性［8］，经胆巴制后的附子易引入无机杂质，炮制后需经过反复漂洗，有效成分极可能在漂洗退胆的过程中大量流失［9］。

附子经过炮制后毒性降低，本课题组从化学成分变化的角度出发，以市场上广泛流通的加胆、加硫炮制的胆附片 （白附片、熟附片）以及部分地区流通的无胆附片 （生附片、蒸附片、炒附片）［10-12］为研究对象，采用酸性染料比色法测定总生物碱含有量、高效液相色谱法测定不同类型生物碱类成分含有量，对其进行质量评价［13］，探讨不同炮制工艺、炮制辅料对附子生物碱类成分的影响。

1 仪器与材料

1.1 仪器与试药 Ethos Tos微波消解萃取仪 （意大利 Milestone公司）；Satorious BP221S系列电子分析天平 （德国Satorious公司）；PHS-3C型PH计（上海仪电科学仪器股份有限公司）；UV-2550紫外分光光度计、LC-10 A高效液相色谱仪 （日本岛津公司）；UPT-Ⅱ-107-优普系列超纯水器 （成都超纯科技有限公司）。

乌头碱 （AC，批号 17022206）、次乌头碱（HAC，批号17111310）、新乌头碱 （MAC，批号16032504）、苯甲酰乌头原碱 （BAC，批号16012815）、苯甲酰次乌头原碱 （BHAC，批号15010806）、苯甲酰新乌头原碱 （BMAC，批号17022806），购自成都曼思特生物科技公司，经HPLC面积归一化法计算含有量＞98%。乙腈 （美国Fisher公司）；四氢呋喃 （成都科隆化工试剂厂）为色谱纯；乙酸铵、溴甲酚绿、二氯甲烷、乙酸乙酯、异丙醇、冰乙酸、甲酸、氨水为分析纯；水为实验室自制超纯水。

1.2 药材 共收集7个厂家 （A-G），22批附子样品，见表1。

1.3 附子炮制品制备［1，14］

1.3.1 生附片 取泥附子，洗净，去皮，切片，干燥。

表1 样品信息Tab.1 Information of samples

1.3.2 白附片 取泥附子，洗净，浸入胆巴水溶液中数日，连同浸液煮至透心，捞出，剥去外皮，纵切成厚约0.3 cm的片，用水浸漂，取出，蒸透，晒干。

1.3.3 熟附片 取泥附子，洗净，浸入胆巴水溶液中数日，连同浸液煮至透心，捞出，剥去外皮，切成厚约7 mm的片，用水浸漂，取出，蒸至透心，出现油面光泽，晒干或烘干。

1.3.4 炒附片 将中等细度的河砂投入炒药机内，炒至滑利，投入生附片，砂炒至外表皮黄棕色，断面黄色，取出，迅速筛去砂子，晾凉。

1.3.5 蒸附片 取生附片，用清水浸润，加热蒸至附子表面出现油面光泽，干燥。

2 方法与结果

2.1 总生物碱测定［15-16］

2.1.1 溴甲酚绿溶液制备 取乙酸铵约27 g，精密称定，置于1 000 mL量瓶中，加超纯水900 mL溶解，加冰乙酸调节pH至6.1±0.1，加超纯水至刻度，摇匀，备用。再取溴甲酚绿约5 g，精密称定，加0.05 mol／L氢氧化钠溶液17.5 mL充分研磨使溶解，转移至1 000 mL量瓶中，再加乙酸-乙酸铵缓冲液稀释至刻度，过滤，即得。

2.1.2 供试品溶液制备 取附子样品粉末约0.5 g，精密称定，置微波消解罐中，加入0.5%甲酸溶液40 mL，密闭，放入微波消解仪中，提取12 min（90℃，800 W）。取续滤液10 mL，用氨水调pH 10～11，氯仿萃取5次，每次10 mL，第1次萃取后放置30 min，其余每次放置10 min，合并萃取液，35℃减压浓缩蒸干，用氯仿溶解并定容至5 mL量瓶中，备用。

2.1.3 对照品溶液制备 精密称取乌头碱对照品7.08 mg，于50 mL量瓶中，加氯仿溶解并定容，制得质量浓度为0.141 6 mg／mL的对照品溶液。

2.1.4 标准曲线绘制

2.1.4.1 波长选择 取乌头碱对照品溶液及供试品溶液适量，置于分液漏斗中，加入氯仿补足15 mL，再加入10 mL溴甲酚绿溶液，剧烈振摇3 min，静置30 min，取氯仿层，用紫外分光光度计在300～500 nm波长范围内，进行全波长扫描，均在403 nm处有最大吸收，故选取403 nm为测定波长。

2.1.4.2 标准曲线绘制 精密量取对照品溶液0.3、0.5、1.0、3.0、5.0 mL，分别置于分液漏斗中，加入氯仿补足15 mL，再加入溴甲酚绿溶液10 mL，剧烈振摇3 min，静置30 min，分层，同法制备溶剂空白溶液，取氯仿层溶液于403 nm处测定吸光度。以对照品溶液质量浓度为横坐标 （X），吸光度为纵坐标 （Y），绘制标准曲线，得回归方程 Y＝26.079X－0.027 1， R2＝0.999 7， 表明乌头碱在2.832～47.2 μg／mL范围内线性关系良好

2.1.5 总生物碱含有量测定 精密量取 “2.1.2”项下供试品溶液2 mL置分液漏斗中，加氯仿补足15 mL，再加入溴甲酚绿溶液10 mL，剧烈振摇3 min，静置30 min，取下层液，于403 nm处测定，见表2。

表2 各样品总生物碱含有量测定结果 （%）Tab.2 Results of content determination of total alkaloids of various samples（%）

2.2 酯型生物碱含有量测定

2.2.1 供试品溶液制备 取附子样品粉末 （过3号筛）约2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加氨试液3 mL，精密加入异丙醇-乙酸乙酯（1∶1）混合溶液50 mL，称定质量，超声处理（功率300 W，频率40 kHz，水温25℃以下）30 min，放冷，再称定质量，用异丙醇-乙酸乙酯 （1∶1）混合溶液补足减失的质量，摇匀，过滤。精密量取续滤液25 mL，40℃以下减压回收溶剂至干，残渣精密加入异丙醇-二氯甲烷 （1∶1）混合溶液3 mL溶解，过滤，取续滤液，即得。

2.2.2 对照品溶液制备 取乌头碱、次乌头碱、新乌头碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱对照品适量，精密称定，加异丙醇-二氯甲烷 （1∶1）混合溶液制成混合对照品溶液，即得，质量浓度分别为 45.4、43.2、46.4、47.4、 41.6、 40.6 μg／mL。

2.2.3 色谱条件 DikmaDianonsil C18柱 （250 mm×4.6 mm， 5 μm）； 流动相乙腈-四氢呋喃 （25∶15）（A）-0.1 mol／L醋酸铵溶液 （B）， 梯度洗脱， 程序见 表 3； 检 测 波 长 235 nm； 体 积 流 量1.0 mL／min； 柱温 30 ℃； 进样量 10 μL。

表3 梯度洗脱程序Tab.3 Gradient elution programs

2.2.4 样品含有量测定 取混合对照品溶液、供试品溶液，注入液相色谱仪，在 “2.2.3”项色谱条件下测定。采用外标一点法计算酯型生物碱含有量，见表4。色谱图见图1。

图1 各成分HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

表4 各样品酯型生物碱含有量测定结果 （mg／mL）Tab.4 Results of content determination of ester alkaloidof various samples （mg／mL）

2015年版 《中国药典》［1］规定黑顺片、白附片双酯型生物碱含有量以乌头碱、次乌头碱、新乌头碱之和计不得过0.020%，单酯型生物碱含有量以苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱之和计不得少于0.010%。《四川省中药饮片炮制规范》［14］规定生附片双酯型生物碱含有量以乌头碱、次乌头碱、新乌头碱之和计为0.10%～0.25%，熟附片、蒸附片、炒附片不得超过0.020%；熟附片单酯型生物碱以苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱之和计不得少于0.010%，蒸附片、炒附片为0.010～0.130%。

3 讨论与结论

3.1 生附片生物碱含有量分析 从总生物碱含有量变化上，江油产生附片总生物碱的含有量为0.580%～0.790%，其中生附片 （去皮）的含有量最高，达到0.790%，云南产生附片的含有量最低，为0.490%。从酯型生物碱含有量变化，江油产生附片的单酯型生物碱含有量为0.020 1%～0.042 4%，云南产生附片为0.014 9%，单酯型生物碱的含有量以江油产较高，云南产较低；江油产生附片双酯型生物碱含有量为0.080 3%～0.170 5%，云南产生附片含有量最高为0.195 7%，双酯型生物碱含有量以云南产较高，江油产较低。见图2。

图2 不同产地生附片生物碱类成分对比Fig.2 Comparison of alkaloids in raw monkhood from different areas

江油为附子的道地产区，其生附片总生物碱含有量高，而双酯型生物碱含有量低，云南生附片总生物碱含有量低，但双酯型生物碱含有量高，从毒与有效成分来看，江油生附片的质量优于云南产的生附子。

此外，生附片去皮后总生物碱含有量增高，表明附片皮部中总生物碱含有量较低，因此去皮炮制，富集有效部位，提高附子炮制品的总生物碱含有量，为附子的炮制提供了新思路。

3.2 白附片产地与炮制工艺分析

3.2.1 产地影响 从总生物碱含有量变化上，江油产白附片总生物碱含有量为0.07%～0.23 0%，云南产白附片含有量为0.244%～0.440%，陕西产白附片含有量为0.128%，即总生物碱含有量云南产＞江油产＞陕西产，其中云南产无胆白附片（D2）含有量最高，达到0.440%。从酯型生物碱含有量变化上，江油产单酯型生物碱白附片含有量为0.010 1% ～0.015 8%，云南产含有量为0.032 6%～0.121 5%，陕西产含有量为0.023 0%，即单酯型生物碱含有量为云南产＞陕西产＞江油产，其中最高者为云南产无胆白附片；江油产白附片双酯型生物碱含有量为0.000 8%～0.003 4%，云南产含有量为0.007 1%～0.019 9%，陕西产含有量为0.015 3%，即双酯型生物碱含有量为云南产＞江油产＞陕西产，含有量最高者亦为云南无胆白附片。见图3。

图3 白附片生物碱类成分对比Fig.3 Comparison of alkaloid components in white monkshood

3.2.2 炮制工艺影响 无胆白附片［17］的炮制工艺为泥附子净制、煮制、切片、蒸制、干燥，不经胆巴炮制、流水漂洗；无胆白附片的总生物碱、单酯型生物碱含有量均高于传统胆巴炮制白附片，同时毒性成分双酯型生物碱含有量也显著高于传统白附片，存性效果较好，而去毒能力不足；传统胆巴炮制白附片工艺相对复杂，但在保证药效的基础上，去毒能力较强。因此，无胆炮制白附片工艺虽具有一定可取之处，但不能完全取代传统胆巴炮制，白附片的无胆巴炮制工艺有待进一步研究优化。

3.3 蒸制工艺影响 白附片总生物碱含有量为0.070%～0.440%，熟附片总生物碱含有量为0.110%～0.130%；白附片单酯型生物碱含有量为0.010 1%～0.121 5%，熟附片单酯型生物碱含有量为0.011 0%～0.012 4%；白附片双酯型生物碱含有量为0.001 2%～0.022 1%，熟附片双酯型生物碱含有量0.001 0%～0.006 3%；白附片的总生物碱、酯型生物碱含有量均高于熟附片。见图4。

图4 白附片与熟附片生物碱类成分对比Fig.4 Comparison of alkaloid content between white and cooked monkshood

白附片与熟附片的炮制工艺相似，但蒸制时间存在差异，熟附片蒸制较长，需蒸至附片表面呈油性光泽。熟附片总生物碱、酯型生物碱含有量均低于白附片，可能蒸制时间过长会造成生物碱类成分流失。

3.4 蒸、炒工艺影响 相比于白附片、熟附片，蒸附片、炒附片的总生物碱与单酯型生物碱的含有量均较高，双酯型生物碱含有量均较低，其中总生物碱含有量蒸附片较高，单酯型生物碱含有量炒附片较高，双酯型生物碱含有量在两种附片中差异不大。见图5。

图5 蒸附片与炒附片生物碱类成分对比Fig.5 Comparison of alkaloid content between steamed and fried monkshood

3.4.1 漂洗影响 蒸附片与炒附片不经胆巴炮制与漂洗，工艺简单，总生物碱及单酯型生物碱含有量均高于白附片、熟附片 （有胆）的平均水平，其总生物碱的保留率较高，双酯型生物碱转化率也较高。白附片、熟附片为胆巴炮制附片，炮制过程中经胆巴水浸泡，后用流水反复漂洗退胆，推测漂洗工艺可能会造成附子中生物碱类成分大量流失。

3.4.2 无胆炮制附子工艺优势 2015年版 《中国药典》规定，采用胆巴水浸泡、煮、漂洗退胆、蒸等系列工序炮制附子，工艺繁琐，尽管能有效去毒，但漂洗退胆过程中损失有效成分而存性不足，同时易引入胆巴中的无机杂质；而无胆蒸制、炒制附子炮制工艺简单，去毒存性且不易引入无机杂质。蒸附片、炒附片现收载于 《四川省中药饮片炮制规范》，主要流通于四川当地，为地方沿用品种，从化学成分及临床反馈看，炮制工艺优势明显，建议 《中国药典》 增加蒸制和炒制工艺［18-19］。3.5 总结 以生物碱类成分的平均含有量对比附子不同炮制品的差异，见图6。

图6 附子不同炮制品生物碱含有量对比Fig.6 Comparison of alkaloid content in different processed products of monkshood

附子各炮制品中总生物碱含有量以生附片最高，其次是蒸附片和炒附片，含有量较低的为白附片及熟附片，即生附片＞蒸附片＞炒附片＞白附片＞熟附片。相比生附片，炮制后的附片单酯型生物碱含有量明显升高，双酯型生物碱含有量明显降低，单酯型生物碱与双酯型生物碱含有量占比发生改变，各炮制品中，单酯型生物碱含有量为炒附片＞蒸附片＞白附片＞生附片＞熟附片，双酯型生物碱含有量为生附片＞白附片＞蒸附片＞炒附片＞熟附片。检测分析表明，不同的炮制方法，能不同程度的降低附子中毒性成分双酯型生物碱的含有量，增加有效成分单酯型生物碱的含有量，达到增效减毒的目的。