HPLC法测定茜草双酯固体分散体中的有关物质

陈 莉 肖若蕾

（咸宁学院药学院，湖北 咸宁 437100）

茜草双酯为促进白细胞增生药，是茜草酸的合成类似物，对各种原因尤其是肿瘤化疗所造成的白细胞减少症有显著的疗效[1]。但茜草双酯在水中几乎不溶，且化学性质不稳定。而以PVP为载体制备的茜草双酯固体分散体能有效的提高茜草双酯的溶出速率[2]，是较理想的茜草双酯制剂。本文利用HPLC法具有方便简捷，分离效果好，结果准确，重现性好的优势，探讨了茜草双酯固体分散体中有关物质的测定方法，以期更好地控制药品质量。

1 实验方法

1.1 仪器与试剂

N3000高效液相色谱系统（北京创新通恒），C18色谱柱（250mm×4.6mm，5μm），Sartoriusag BP211D电子天平（北京赛多利斯）。

茜草双酯固体分散体（自制，每克茜草双酯固体分散体含0.1g茜草双酯）；茜草双酯标准品（紫外含量测定用，中国药品生物制品检定所，100418-200401）；PVPK30（上海化学试剂公司，040914）；乙腈为色谱纯，其他为分析纯，重蒸水自制。

1.2 色谱条件

色谱柱：C18色谱柱（250mm×4.6mm，5μm）；流动相为乙腈∶水=70∶30；流速为1.0mL/min；紫外检测波长为264nm；柱温：室温；进样量为20μL。理论塔板数为8351，重复性试验符合要求。

1.3 方法的专属性考察

将茜草双酯溶液进行强碱、强酸、强氧化、光照等破坏性试验，考察拟订的色谱条件下各中间体和降解产物分离情况。

1.3.1 强酸破坏试验

称取茜草双酯对照品约10mg，用20mL流动相溶液溶解，置100mL容量瓶中，加入2.0mL的盐酸溶液（1.0mol/L），振摇，于80℃水浴中加热30min，取出，冷却至室温，用氢氧化钠溶液（0.5mol/L）调pH=5，再用流动相溶液稀释至刻度，摇匀。

1.3.2 强碱破坏试验

称取茜草双酯对照品约10mg，用20mL流动相溶液溶解，置100mL容量瓶中，加入2.0mL的氢氧化钠溶液（1.0mol/L），振摇，于80℃水浴中加热30min，取出，冷却至室温，用的盐酸溶液（0.5mol/L）调pH=5后，再用流动相溶液稀释至刻度，摇匀。

1.3.3 氧化破坏试验

称取茜草双酯对照品约10mg，用20mL流动相溶液溶解，置100mL容量瓶中，加入30%的过氧化氢溶液2.0mL，振摇，于80℃水浴中加热30min，取出，冷却至室温，再用流动相溶液稀释至刻度，摇匀。

1.3.4 强光照射破坏试验

称取茜草双酯对照品约10mg，用适量流动相溶液溶解，置100mL容量瓶中，置阳光下照射3h，用流动相溶液稀释至刻度，摇匀。

分别取上述方法破坏后的茜草双酯溶液适量，微孔滤膜过滤，按1.2项下色谱条件进样，观察主峰与各杂质峰的分离情况，结果如图1。

由破坏性实验的高效液相色谱图可知，在拟订的色谱条件下，有关物质和降解产物的色谱峰出峰在主峰前，有关物质及辅料色谱峰与主成分茜草双酯峰可以有效分离。据此，将有关物质检查的记录时间拟订为主峰保留时间的2倍。实验结果表明：碱性条件下茜草双酯尤其不稳定，茜草双酯只有极少量存在，破坏产物极性较强，在本色谱条件下，基本不保留；茜草双酯在其他破坏性实验条件下有关物质和降解产物也明显增加，因反应机理较复杂，未能确定其主要降解产物的化学结构。

1.4 线性关系试验

精密称取茜草双酯标准品适量，用流动相溶解配制成100.0μg/mL的对照品贮备液。分别移取不同体积的对照品贮备液于10mL棕色容量瓶中定容，摇匀。按1.2项下色谱条件进样，并测定。记录色谱流出曲线，以峰面积（A）对浓度C进行线性回归，茜草双酯在浓度10.0～100.0μg/mL范围内呈良好线性关系，回归方程为A=2.76×104C+8.03×103，r=0.9997。

1.5 最低检测限

按信噪比为3（S/N=3）作为最低检测限，以浓度为10ng/mL，进样20μL时，主产物峰信号约为基线噪音的3倍，即最低检测限为0.2ng。

1.6 重复性试验

精密称取同批茜草双酯固体分散体，共6份（约含茜草双酯5mg），置50mL容量瓶中，用流动相溶液稀释至刻度，摇匀，再从中移取5mL至10mL棕色容量瓶中定容，摇匀。按1.2项下色谱条件测定，记录色谱图。结果：茜草双酯平均含量为97.2%，RSD=1.02%（n=6）。

图1 茜草双酯及其破坏性实验的高效液相色谱图

1.7 溶液的稳定性

精密称取茜草双酯固体分散体适量（约含茜草双酯5mg），溶于流动相溶液，置50mL容量瓶中，用流动相溶液稀释至刻度，摇匀，将所得样品溶液在室温且避光条件下放置0，1，2，3，4h后分别取样测定，得主峰峰面积的RSD为0.29%，表明茜草双酯溶液在4h内稳定。

2 茜草双酯固体分散体中有关物质的测定

2.1 茜草双酯固体分散体的制备

茜草双酯-PVP固体分散剂，将茜草双酯与PVP以1∶5的比例溶于适量的无水乙醇，经减压蒸发除去乙醇，在干燥器内平衡数日，粉碎过八十目筛，得固体分散体样品[2]，备用。

2.2 试样溶液的配制

精密称取不同次制备的茜草双酯固体分散体各一份（约含茜草双酯5mg），置50mL容量瓶中，用流动相溶液稀释至刻度，摇匀。按1.2项下色谱条件测定，记录色谱图至主成分保留时间的2倍，供试品如显杂质峰，按峰面积归一化法计算杂质含量。结果如表1。

表1 茜草双酯固体分散体中有关物质测定结果

3 讨 论

有关物质的检查是保证药品安全有效的重要指标之一，由于茜草双酯化学性质不稳定，易发生氧化和水解等化学反应，其原料药及制剂的有关物质检查更不容忽视，因此，必须选择专属性强、灵敏度高、重复性好的方法。茜草双酯原料药的有关物质检测HPLC方法已经建立。本研究建立的HPLC方法测定茜草双酯固体分散体中有关物质的方法表明主峰与各杂质峰均能达到较好分离，具有灵敏度高的优点，可用于茜草双酯固体分散体中有关物质测定。

实验过程中比较了不同的溶剂，包括：乙醇-水，无水乙醇，甲醇，乙腈及本实验所用的流动相，由于茜草双酯化学性质不稳定，易氧化和水解及不易溶于水的特点，同时可以减少溶剂峰对图谱效果的影响，便于观察与区分杂质峰，最终确定选择流动相作溶剂，并在实验过程应注意避光处理，此时样品可较好溶解，且在4h内稳定。

本实验比较了各种流动相对分离效果的影响∶甲醇-水-四氢呋喃=70∶30∶5，甲醇-水-四氢呋喃=70∶20∶5，甲醇-水=80∶20，甲醇：水=70：20，乙腈：水：四氢呋喃=70∶30∶5，乙腈∶水=70∶30，得出当流动相为乙腈∶水=70∶30时，茜草双酯及有关物质的色谱峰峰型、分离度均较好，拖尾因子小，出峰时间合适。

[1] 王升启,马立人.茜草属药用植物的化学成分及生物活性[J].军事医学科学院院刊,1991,14(4):254-259.

[2] 肖若蕾,陈莉.茜草双酯固体分散体的制备及体外溶出实验[J].解放军药学学报,2009,25(5):457-459.