LncRNA MFI2-AS1靶向miR-331-3p调节LPS诱导的心肌细胞损伤

雷肖蠢 张海良 丁鹏

脓毒症是临床常见的一种全身性炎症疾病之一，严重时可引发心脏等多器官功能障碍，但关于其发病机制尚未阐明[1]。既往研究显示炎性反应与心肌细胞过度凋亡是促使心肌损伤的重要原因[2-4]。研究表明脂多糖(lipopolysacharide，LPS)可与心肌细胞表面相关受体结合而促进炎性反应的发生从而造成心肌细胞功能障碍，其可用于建立体外心肌细胞损伤模型[5]。因而深入探究心肌细胞损伤机制有助于改善患者预后。长链非编码RNA MFI2-AS1(Long non-coding RNA MFI2-AS1，LncRNA MFI2-AS1)在LPS诱导的软骨细胞中呈高表达，敲低MFI2-AS1表达可抑制骨关节炎进展[6]。生物信息学分析显示微小RNA-331-3p(microRNA-331-3p，miR-331-3p)可能是MFI2-AS1的靶基因，研究表明miR-331-3p在胰腺癌发生过程中发挥癌基因作用[7]。但MFI2-AS1是否靶向miR-331-3p参与心肌细胞损伤过程尚未可知。本研究通过LPS诱导心肌细胞构建细胞损伤模型，观察细胞中MFI2-AS1与miR-331-3p的表达水平，分析其对细胞增殖及凋亡的影响，旨在为揭示心肌损伤的分子机制奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 大鼠心肌细胞H9c2购自美国ATCC细胞库。杜氏改良培养基(DMEM)购自美国Gibco公司；胎牛血清(fatal bovine serun，FBS)购自上海玉博生物科技有限公司；LPS购自上海睿安生物科技有限公司；Trizol试剂与pcDNA3.1购自美国Invitrogen公司；Lipofectamine2000购自美国Thermo Fisher Scientific公司；反转录试剂盒与荧光定量PCR试剂盒购自日本TaKaRa公司；MFI2-AS1小干扰RNA(si-MFI2-AS1)、乱序无意义阴性序列(si-NC)、miR-331-3p寡核苷酸模拟物(miR-331-3p mimics)及阴性对照mimic NC序列(miR-NC)购自广州锐博生物科技有限公司；miR-331-3p特异性寡核苷酸抑制剂(anti-miR-331-3p)及阴性对照(anti-miR-NC)购自上海吉玛制药技术有限公司；甲基噻唑基四唑(methylthiazolyl tetrazolium，MTT)、RIPA裂解液与二喹啉甲酸(bicinchoninicacid，BCA)蛋白定量检测试剂盒购自美国Sigma公司；膜联蛋白V(Annexin V)-异硫氰酸荧光素(FITC)/碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)细胞凋亡试剂盒购自北京博尔迈生物技术有限公司；双荧光素酶活性检测试剂盒购自美国Promega公司；兔抗鼠活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved-caspase-3)、细胞周期蛋白1(CyclinD1)抗体购自美国CST公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG二抗购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养、转染及实验分组:采用含有10% FBS与100 U/ml青霉素与100 μg/ml链霉素的DMEM培养基培养H9c2细胞，置于37℃恒温培养箱进行培养，待细胞生长至70%时进行传代培养。取对数期H9c2细胞，使用含有10 μg/ml的LPS处理H9c2细胞24 h[8]，记作LPS组。将未进行处理的H9c2细胞作为NC组。取对数期H9c2细胞，将培养基更换为不含血清的培养基，分别将si-NC、si-MFI2-AS1、miR-NC、miR-331-3p mimics、si-MFI2-AS1与anti-miR-NC、si-MFI2-AS1与anti-miR-331-3p转染至H9c2细胞，继续培养48 h，随后使用含有10 μg/ml的LPS处理H9c2细胞24 h，分别记作LPS+si-NC组、LPS+si-MFI2-AS1组、LPS+miR-NC组、LPS+miR-331-3p组、LPS+si-MFI2-AS1+anti-miR-NC组、LPS+si-MFI2-AS1+anti-miR-331-3p组。

1.2.2 实时荧光定量聚合酶链反应(Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR)检测细胞中MFI2-AS1、miR-331-3p的表达水平:采用Trizol法提取各组心肌细胞中总RNA，应用紫外分光光度计测定RNA浓度。MFI2-AS1正向引物5’-TGAGACGACATCCCTTCCAG-3’，反向引物5’-GGCCCTGAAATGACTTGCTC-3’；miR-331-3p正向引物5’-GATCCCAGATCAAACCAGGC-3’，反向引物5’-GCATGTTCTCCAGATGTCCTTTA-3’，引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。按照反转录试剂盒说明书将总RNA反转录合成cDNA，qRT-PCR反应体系：SYBR Green Master Mix 10 μl，正反向引物0.8 μl，cDNA 1 μl，ddH2O补足体系至20 μl；反应条件：95℃ 5 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共循环40次。MFI2-AS1以β-actin为内参，miR-331-3p以U6为内参，采用2-ΔΔCt法计算MFI2-AS1、miR-331-3p的相对表达量。

1.2.3 MTT检测细胞存活率:收集各组中对数期的心肌细胞，并调整细胞密度(5×104个/ml)，接种于96孔板上(100 μl/孔)，于转染48 h时向每孔中加入20 μl MTT，37℃恒温培养箱内继续培养4 h，弃上清，每孔加入150 μl二甲基亚砜(DMSO)，利用酶标仪检测各孔在波长为490 nm处的相对吸光度值(OD)，计算细胞存活率(%)=(各实验组OD值-空白对照组OD值)/(正常对照组OD值-空白对照组OD值)×100%。

1.2.4 流式细胞术检测细胞凋亡率:收集各组对数期心肌细胞，预冷PBS洗涤，加入5 μl Annexin V-FITC，混匀，加入5 μl PI，混匀，室温避光孵育10 min，置于FACS Calibur流式细胞仪及应用Cellauest软件检测各组细胞凋亡率。

1.2.5 双荧光素酶报告基因检测MFI2-AS1的靶基因:starbase预测显示MFI2-AS1与miR-331-3p存在靶向关系，将含有结合位点及突变位点分别插入荧光素酶报告基因载体构建野生型质粒WT-MFI2-AS1与突变型质粒MUT-MFI2-AS1，分别将WT-MFI2-AS1、MUT-MFI2-AS1与miR-NC、miR-331-3p mimics共转染至H9c2细胞，分别记作miR-NC组(WT-MFI2-AS1)、miR-331-3p组(WT-MFI2-AS1)、miR-NC组(MUT-MFI2-AS1)、miR-331-3p组(MUT-MFI2-AS1)。各组继续培养48 h，收集细胞，参照荧光素酶活性检测试剂盒检测各组细胞相对荧光素酶活性。同时分别将si-NC、si-MFI2-AS1、pcDNA-NC、pcDNA-MFI2-AS1转染至H9c2细胞，qRT-PCR检测各组细胞中miR-331-3p的相对表达量。

1.2.6 蛋白免疫印迹(Western blot)检测Cleaved-caspase-3、CyclinD1蛋白表达:收集各组对数期H9c2细胞，加入200 μl RIPA，冰上裂解30 min，4℃条件下经1 000 r/min离心10 min，吸取上清液(总蛋白)。取30 μg 蛋白样品与上样缓冲液充分混匀，高温煮沸15 min，蛋白变性。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白，转膜、封闭，加入Cleaved-caspase-3(稀释比1∶1 000)、CyclinD1(1∶1 000)、β-actin(稀释比1∶2 000)一抗稀释液，洗膜，加入二抗(1∶5 000)，ECL显影，应用Quantityone软件检测条带灰度值。

2 结果

2.1 在心肌细胞H9c2中LncRNA MFI2-AS1和miR-331-3p表达情况 与NC组相比，LPS组心肌细胞中MFI2-AS1的表达水平显著升高(P<0.05)，miR-331-3p的表达水平显著降低(P<0.05)。见表1。

表1 在心肌细胞H9c2中LncRNA MFI2-AS1和miR-331-3p表达情况

2.2 低表达MFI2-AS1对LPS处理的H9c2的增殖和凋亡影响 与NC组相比，LPS组心肌细胞凋亡率显著升高(P<0.05)，细胞存活率显著降低(P<0.05)，Cleaved-caspase-3蛋白相对表达量显著升高(P<0.05)，CyclinD1蛋白相对表达量显著降低(P<0.05)；与LPS+si-NC组相比，LPS+si-MFI2-AS1组心肌细胞凋亡率显著降低(P<0.05)，细胞存活率显著升高(P<0.05)，Cleaved-caspase-3蛋白相对表达量显著降低(P<0.05)，CyclinD1蛋白相对表达量显著升高(P<0.05)。见表2，图1。

表2 低表达MFI2-AS1对LPS处理的H9c2的增殖和凋亡影响

图1 低表达MFI2-AS1对LPS处理的H9c2的增殖和凋亡影响;A 流式细胞仪检测细胞凋亡；B Western Blot检测CyclinD1和Cleaved-caspase-3蛋白的表达

2.3 高表达miR-331-3p对H9c2的增殖和凋亡的影响 与LPS+miR-NC组相比，LPS+miR-331-3p组心肌细胞存活率显著升高(P<0.05)，细胞凋亡率显著降低(P<0.05)，Cleaved-caspase-3蛋白相对表达量显著降低(P<0.05)，CyclinD1蛋白相对表达量显著升高(P<0.05)。见图2,表3。

表3 高表达miR-331-3p对H9c2的增殖和凋亡的影响

图2 Western Blot检测CyclinD1和Cleaved-caspase-3蛋白的表达

2.4 LncRNA MFI2-AS1靶向调控miR-331-3p的表达 starbase预测显示miR-331-3p和MFI2-AS1存在结合位点。双荧光素酶报告实验结果显示，共转染野生型质粒WT-MFI2-AS1的心肌细胞中，miR-331-3p组荧光素酶活性显著低于miR-NC组，差异有统计学意义(P<0.05)；共转染突变型质粒MUT-MFI2-AS1的心肌细胞中，miR-331-3p组与miR-NC组荧光素酶活性相比差异无统计学意义(P>0.05)。qRT-PCR检测结果显示，与si-NC组相比si-MFI2-AS1组心肌细胞中miR-331-3p的表达水平显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与pcDNA-NC组相比，pcDNA-MFI2-AS1组心肌细胞中miR-331-3p的表达水平显著降低(P<0.05)。见图3，表4、5。

图3 通过starbase预测miR-331-3p和MFI2-AS1结合示意图

表4 miR-NC或miR-331-3p与报告质粒共转染H9c2细胞后双荧光素酶活性检测

表5 qRT-PCR检测miR-331-3p的表达

2.5 低表达miR-331-3p可以部分逆转MFI2-AS1低表达对H9c2增殖和凋亡的影响 与LPS+si-MFI2-AS1+anti-miR-NC组相比，LPS+si-MFI2-AS1+anti-miR-331-3p组心肌细胞存活率显著降低(P<0.05)，细胞凋亡率显著升高(P<0.05)，Cleaved-caspase-3蛋白相对表达量显著升高(P<0.05)，CyclinD1蛋白相对表达量显著降低(P<0.05)。见图4，表6。

图4 Western Blot检测CyclinD1和Cleaved-caspase-3蛋白的表达

表6 低表达miR-331-3p可以部分逆转MFI2-AS1低表达对H9c2增殖和凋亡的影响

3 讨论

LncRNA可通过调控下游miRNA的表达从而参与心肌细胞凋亡及心肌细胞损伤过程[9,10]。但仍有部分LncRNA在心肌细胞损伤过程中的调控机制尚未阐明。因而本研究积极探寻新型LncRNA并分析其如何调控miRNA而发挥作用。

MFI2-AS1在神经胶质瘤与肾细胞癌等肿瘤中异常表达并可参与肿瘤发生及发展过程[11,12]。但MFI2-AS1在心肌细胞损伤中的表达尚未可知。本研究通过LPS诱导心肌细胞，结果发现细胞中MFI2-AS1的表达水平明显升高，提示MFI2-AS1表达量升高可能促进心肌损伤的发生。研究表明CyclinD1表达量升高可促进细胞周期由G1期进入S期，促进细胞增殖，若细胞接收凋亡信号时，细胞凋亡蛋白可激活caspase-3级联反应从而促进Cleaved-caspase-3表达量升高最终诱导细胞凋亡[13,14]。本研究结果显示LPS处理后可明显降低心肌细胞存活率，促进细胞凋亡，CyclinD1表达量降低，Cleaved-caspase-3表达量升高。提示LPS可促进心肌细胞凋亡，抑制细胞增殖从而破坏细胞增殖/凋亡的平衡状态最终造成心肌损伤。本研究进一步分析显示抑制MFI2-AS1表达后心肌细胞凋亡率降低，细胞存活率升高，CyclinD1表达上调，Cleaved-caspase-3表达下调，提示抑制MFI2-AS1表达可促进LPS诱导的心肌细胞存活，抑制细胞凋亡。

miR-331-3p在多发性骨髓瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌等多种肿瘤中异常表达并可参与肿瘤细胞增殖及凋亡过程[15-17]。但miR-331-3p在心功能障碍发生过程中的表达及其作用机制尚未可知。本研究结果显示LPS诱导的心肌细胞中miR-331-3p的表达水平明显降低，进一步研究显示miR-331-3p过表达可明显促进心肌细胞存活，抑制细胞凋亡，并可促进CyclinD1表达，抑制Cleaved-caspase-3表达，提示miR-331-3p过表达可能通过上调CyclinD1表达及下调Cleaved-caspase-3表达从而减轻LPS诱导的心肌细胞损伤。同时本研究通过双荧光素酶报告实验与qRT-PCR实验证实MFI2-AS1可靶向调控miR-331-3p的表达，进一步研究显示抑制miR-331-3p表达可明显减弱抑制MFI2-AS1表达对LPS诱导的心肌细胞凋亡的抑制作用，及其对细胞增殖的促进作用。提示抑制MFI2-AS1表达可能通过上调miR-331-3p表达从而保护心肌细胞免受损伤。

综上所述，抑制MFI2-AS1表达对LPS诱导的心肌细胞具有保护作用，其作用机制与MFI2-AS1靶向调控miR-331-3p的表达有关，通过调控MFI2-AS1表达可增强心肌细胞增殖能力，改善心脏功能，可为阐明脓毒症所致心功能障碍的分子机制奠定理论基础。