ApoE基因多态性与缺血性脑卒中合并2型糖尿病的相关性分析

邱硕程 何竹涵 黄志伟 王景 王建欣 杨继章

脑卒中是一种因大脑动脉狭窄、闭塞或破裂而引起的脑血管疾病，导致临床急性脑血流循环障碍综合征,在老年患者中常见，具有高发病率的特点，现已成为中国居民造成死亡的首位原因[1]，近年来其发病率呈不断上升趋势[1,2]。其中缺血性脑卒中约占全部脑卒中的80%[3]，一项国内的调查显示我国缺血性脑卒中的残疾率达16.23%[4]。由此引起我国医学界的高度重视，急性缺血性卒中的诊断与治疗有了较大进展，随着急性期血管再通治疗的大型随机对照临床试验及高质量Meta 分析，以及轻型脑卒中与短暂性脑缺血发作双联抗血小板治疗的随机对照临床试验结果的公布，产生了许多改变临床实践的新的循证医学证据，特别是在静脉溶栓和血管内治疗扩大适应证方面取得了长足进步。伴随着缺血性脑卒中的诊断与治疗的进步，科研人员对其影响因素也在进行不断地探讨。在造成缺血性脑卒中的诸多因素中，2型糖尿病是一个重要的独立危险因素[5]，随着糖尿病病程的进展，可引起血管内皮损伤，进而促进动脉粥样硬化的形成，增加缺血性脑卒中发生的风险[6]。载脂蛋白E(ApoE)是一种多态蛋白，在脂蛋白代谢中起到重要的作用，有研究表示ApoE基因多态性与缺血性脑卒中和2型糖尿病密切相关[7,8]。缺血性脑卒中合并2型糖尿病的高致残率严重影响患者的自理能力，以及其高复发率和高死亡率给患者家庭及社会带来了沉重的负担[9]。本研究采用病例-对照的研究方法，探讨ApoE基因多态性在缺血性脑卒中合并(不合并)2型糖尿病患者中的分布规律及可能的危险因素，旨为该类疾病的防治提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2018年6月至2019年2月于河北医科大学第一医院收治并确诊为缺血性脑卒中的患者512例。根据患者是否合并2型糖尿病，分为缺血性脑卒中合并2型糖尿病(T2DM)组(164例)和缺血性脑卒中不合并2型糖尿病(NC)组(348例)。其中T2DM组男97例，女67例；平均年龄(66.59±10.18)岁；NC组男204例，女144例；平均年龄(66.22±11.20)岁。本研究经医院伦理委员会批准。

1.2 入选标准与排除标准

1.2.1 入选标准:①缺血性脑卒中的诊断标准符合《中国急性缺血性脑卒中诊治指南(2018)》[10]，并经头颅CT和(或)磁共振(MRI)确诊。② 2型糖尿病的诊断标准符合《中国2型糖尿病防治指南(2017年版)》[11]中糖尿病诊断的相关标准。

1.2.2 排除标准:①合并血管炎患者；②合并严重肝肾功能不全患者；③诊断为短暂性脑缺血发作患者；④合并精神病及肿瘤患者；⑤原始资料不全等患者。

1.3 仪器与试剂 STEPONE PLUS实时荧光定量PCR仪(美国ABI公司)；AU5800全自动生化分析仪(美国贝克曼公司)；HYDRASYS2全自动电泳仪(法国SEBIA公司)；TGL-18C离心机(上海安亭科学仪器厂)；PHARM-GENE 01 SNP分析保存液、PHARM-GENE 200 SNP分析样本处理试剂、预处理液(北京华夏时代基因科技发展有限公司，批号：20160503)；人类ApoE基因型检测试剂盒(武汉友芝友医疗科技股份有限公司)。

1.4 血生化指标检测 入院后抽取患者空腹外周血5 ml，3 000 r/min离心10 min以分离血清，检测空腹血糖、糖基化血红蛋白(HbA1c)、总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、血清肌酐(Cr)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、肌酸激酶(CK)等指标。

1.5 ApoE基因检测 取患者血样2 ml进行EDTA抗凝和DNA提取，将提取的DNA置于-20℃冰箱内保存，备用。将相关引物(上游为:5’-AGG GTG CTG ATG GAC GAG AC-3’,下游引物:5’-GCT CAC GGA TGG TGC TGA GG-3’) 加入上述提取的DNA中，进行多个循环的PCR扩增(37℃，10 min；95℃，5 min；95℃，15 s；60℃，60 s，40个循环)。设置FAM、VIC和ROX 3通道采集荧光信号。将扩增的产物样本的荧光曲线用基因芯片阅读仪读取结果。

2 结果

2.1 患者一般临床资料及生化资料比较 将生化指标(TC、TG、LDL-C、HDL-C、Cr、ALT、AST、CK)进行正态性检验，结果显示均为非正态分布(P<0.05)，采用Mann-Whitney U检验。Mann-Whitney U检验和2检验的结果显示，T2DM组与NC组在性别比、年龄、是否合并高血压、是否合并高脂血症、TC、LDL-C、Cr、ALT上比较无显著差异(P>0.05)。T2DM组的TG含量比NC组高，且差异有统计学意义(P<0.05)，而在AST、CK和HDL-C上显著低于NC组(P<0.05)。见表1。

表1 患者一般资料及生化资料比较

2.2 Hardy-Weinberg遗传平衡检验 使用2检验对NC组患者ApoE的基因型分布频率进行Hardy-Weinberg遗传平衡验证，结果显示NC组基因型符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律(P>0.05)，表明该抽样具有代表性。见表2。

表2 Hardy-Weinberg遗传平衡检验

2.3 3组ApoE基因型及等位基因的分布特征比较 与NC组相比T2DM组的ApoE基因型及其等位基因频率差异无统计学意义(P>0.05)。本次研究的512例缺血性脑卒中患者中，ApoE含3种等位基因(E2，E3，E4)和6种基因型(E2/E2，E2/E3，E2/E4，E3/E3，E3/E4，E4/E4)。其中分布频率以等位基因ApoE3最多占比80.86%，ApoE4其次占比10.06%，ApoE2分布最少占比9.08%。E2/E2基因型3例(0.59%)、E2/E3基因型78例(15.23%)、E2/E4基因型9例(1.76%)、E3/E3基因型331例(64.65%)、E3/E4基因型88例(17.19%)、E4/E4基因型3例(0.59%)。见表3。

表3 2组ApoE基因型比较 例(%)

2.4 同性别各组基因型特征关系 将T2DM组与NC组按性别划分进行比较，结果显示T2DM组男性与NC组男性、T2DM组女性与NC组女性在ApoE基因型上亦无显著差异(P>0.05)。见表4。

表4 按性别划分T2DM组与NC组基因型比较 例(%)

2.5 合并2型糖尿病危险因素分析 以脑卒中患者是否合并2型糖尿病为因变量，将合并高脂血症、合并高血压、ApoE基因、TC、TG、LDL-C、HDL-C、Cr、ALT、AST、CK作为自变量，进行Logistic回归分析。结果显示，合并高脂血症、合并高血压、TG、HDL-C是缺血性脑卒中患者合并2型糖尿病的危险因素(P<0.05)，而ApoE基因不是缺血性脑卒中患者合并2型糖尿病的危险因素(P>0.05)。见表5。

表5 Logistic回归分析

3 讨论

ApoE是一种多功能蛋白，含有299个氨基酸，与体内脂蛋白的代谢密切相关，对于维持胆固醇平衡及血脂代谢起十分重要的作用。ApoE有3种等位基因(E2,E3,E4)，在人群中有6种不同的表型：3种纯合子(E2/E2、E3/E3、E4/E4)与3种杂合子(E2/E3、E2/E4、E3/E4)。在亚洲进行的流行病学研究中表明ApoE3是最常见的基因型[12]。在本次研究的资料中ApoE3基因在脑卒中患者分布频率最多(80.86%)，与以上研究结果相符。大量文献报道，ApoE基因多态性对体内血脂代谢具有一定的影响，易导致一系列的心脑血管疾病[13,14]。缺血性脑卒中作为我国最主要的心血管疾病，分型比较多,危险因素十分复杂,且不同种族差异较大,导致ApoE基因与缺血性脑卒中的关系不是十分确定，但是仍然还是有大量研究表明，在亚洲人群中ApoEε4等位基因极有可能是缺血性脑卒中的危险因素，作用机制可能是影响了人体内血脂的水平[15]。同时ApoE基因多态性与糖尿病的发生及脂代谢紊乱也有一定关联[14,16,17]。王阿元[18]的研究表明，2型糖尿病常伴有高脂血症的现象；因此缺血性脑卒中患者发生2型糖尿病的风险是正常人的1.5～3倍[19]。Chen等[8]的Meta分析结果显示ApoE的多态性与2型糖尿病的发生率有关。某些学者的研究结果显示，ApoE4和E2基因可能与中国汉族人群2型糖尿病肾病、糖尿病周围神经病变、糖尿病视网膜病变、糖尿病足、冠心病的风险增加有关[20-26]。但刘文秀等[27]对云南纳西族ApoE基因对2型糖尿病患病率的影响相关研究显示，在云南纳西族中ApoE E4基因对2型糖尿病无影响，李悦等[28]对新疆维吾尔族ApoE基因的多态性与糖尿病患病率的研究结果也显示ApoE与糖尿病无关。Srirojnopkun等[29,30]的研究也赞同ApoE基因多态性与糖尿病无关。

本研究NC组患者ApoE基因型分布符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律，表明抽样具有代表性。在检验数据分布的正态性后采用Mann-Whitney U检验、2检验进行组间比较，结果显示ApoE基因多态性与缺血性脑卒中患者是否合并2型糖尿病可能无关，且Logistic回归分析显示高脂血症、高血压、TG、HDL-C是缺血性脑卒中患者合并2型糖尿病的危险因素，而ApoE基因多态性不是其危险因素。该结果与刘文秀等[27,28]研究的结论相符，但与以上部分学者的研究结果尚有差异，其原因可能与地域民族的遗传特异性、本研究的研究人群为缺血性脑卒中患者、基因-基因和(或)基因-环境的交互作用以及糖尿病及其并发症机制的复杂性等因素有关。既往大量的研究表明，种族遗传的差异不可忽视，近年Chen等[31]的研究就证实了ApoE基因型具有种族及地域特异性。本研究的对象为河北省汉族患者，与其他学者的研究对比具有一定局限性。同时上述学者的研究对象大多是在正常人群的基础上发生有2型糖尿病及其并发症，而本研究的群体为缺血性脑卒中患者，缺血性脑卒中患者危险因素的多元性可能会对结果有所影响。此外复杂疾病的发生发展往往会涉及到多个基因之间、基因与环境之间的交互作用，因而在与基因相关的研究中会产生很大的影响。糖尿病及其并发症机制的复杂性使得研究很难从单一的基因角度对其进行分析，亦可能对研究结果产生影响。但同时发现高脂血症、高血压、TG、HDL-C为合并2型糖尿病的危险因素。徐国超等[32,33]的研究表明，患者血糖水平与HDL-C水平为负相关，与TG水平呈正相关,与本研究显示的HDL-C和TG是糖尿病的危险因素之一相符。王阿元等[18,34]的研究表明，2型糖尿病会促使高血脂疾病发生及增加患者发生高血压的风险，与本研究结果显示的高血压和高脂血症是合并2型糖尿病的危险因素相符。

由于先前学者的研究大多是在正常人群中研究ApoE基因型和等位基因对其发生糖尿病或脑卒中的关系，对于特定的脑卒中群体不具有普遍适用性，在预防脑卒中患者并发症的发生以及脑卒中可能存在的危险因素上具有局限性。对此本研究首次选择在缺血性脑卒中患者人群中探究了ApoE基因多态性与其合并2型糖尿病的关系。但本研究在患者的筛选和统计分析中可能存在偏倚与缺漏；研究的样本量相对较少，研究纳入的范围相对较小，未排除由于生活习惯以及环境等外在因素的作用，且不同地区和种族的遗传差异可能会对结果造成影响。后期需加大样本量、收集多地区多种族的患者资料、多因素筛选分析来进一步探究缺血性脑卒中患者ApoE基因多态性对于其合并2型糖尿病的影响。为临床医生和决策者在预防缺血性脑卒中患者并发2型糖尿病上提供参考。