miR-135b-5p对IL-1β诱导软骨细胞损伤的影响及机制研究

赵晓东 王磊

骨关节炎是最常见的关节疾病，是引发疼痛和残疾的主要原因[1]。骨关节炎的主要特征包括关节软骨的进行性退变、软骨下骨重建和关节炎症，最终导致严重的关节疼痛和功能丧失[2,3]。目前的骨关节炎药物部分有效，使骨关节炎患者的治疗策略有限，只能缓解疼痛或最终进行关节置换[4]。软骨细胞是关节软骨中唯一的细胞，通过细胞凋亡和细胞因子的产生，在骨性关节炎的病理进展中起关键作用[5]。因此，减轻软骨细胞凋亡和炎性反应是一种有效的骨关节炎治疗手段。研究表明，微小RNA-135b-5p(microRNA-135b-5p，miR-135b-5p)在氧-葡萄糖剥夺和复氧(Oxygen-glucose deprivation and reoxygenation，OGD/R)处理的海马神经元细胞中表达显著降低，过表达miR-135b-5p可显著抑制OGD/R诱导的海马神经元细胞损伤和氧化应激[6]。MiR-135b在1-甲基-4-苯基吡啶(1-methyl-4-phenylpyridinium，MPP+)诱导的SH-SY5Y细胞损伤中下调表达，过表达miR-135b可促进MPP+诱导的SH-SY5Y细胞增殖，抑制细胞凋亡和肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白介素-1β(Inter leukin-1β，IL-1β)的产生[7]。血管生成素样蛋白2(Angiopoietin-like 2，ANGPTL2)在骨关节炎软骨和IL-1β刺激后的软骨细胞中表达明显上调，表达上调的ANGPTL2可以促进慢性炎症介质IL-1β、白介素-6(Interleukin-6，IL-6)的表达[8]。ANGPTL2在糖尿病肾病大鼠肾组织中表达量明显升高，ANGPTL2可能通过下调Nephrin及Podocin表达参与足细胞损伤机制[9]。但miR-135b-5p在IL-1β诱导软骨细胞损伤中的表达及其对IL-1β诱导软骨细胞损伤的影响，且miR-135b-5p是否通过靶向调控ANGPTL2的表达影响IL-1β诱导软骨细胞损伤目前还尚未可知。因此，本研究考察miR-135b-5p对IL-1β诱导的软骨细胞损伤的作用，并结合ANGPTL2，旨在探索其潜在的作用机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 SD大鼠(4周龄清洁级级，雌雄不限)购自上海斯莱克实验动物公司，IL-1β购自美国Sigma公司，DMEM培养基(Dulbecco，s modified eagle medium)、青霉素-链霉素双抗混合液购自美国Hyclone公司，胎牛血清购自美国GIBCO公司，miR-NC、miR-135b-5p、anti-miR-NC、anti-miR-135b-5p、pcDNA、pcDNA-ANGPTL2购自武汉淼灵生物科技有限公司，逆转录试剂盒、实时荧光定量PCR(Quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR)试剂盒购自美国应用生物系统公司，IL-6、TNF-α、γ干扰素(Interferon-γ，IFN-γ)酶联免疫(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA)试剂盒、异硫氰酸荧光素标记的膜联素Ⅴ(Annexin Ⅴ-fluorescein isothiocyanate，Annexin Ⅴ-FITC)细胞凋亡检测试剂盒购自碧云天生物技术公司，ANGPTL2购自中国Proteintech公司，B细胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/lewkmia-2，Bcl-2)抗体、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 Associated X Protein，Bax)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗体、辣根过氧化物酶标记二抗购自美国Cellular Signaling Technology公司。

1.2 细胞分离、培养 SD大鼠膝关节软骨细胞的分离参照吴子健[10]的方法进行操作。将分离到的软骨细胞置于含10%胎牛血清、100 U/ml青-链霉素的DMEM培养基中培养，并于37℃、5% CO2的培养箱中孵育。

1.3 细胞转染与处理 选取第二代生长状态良好的软骨细胞，以适当密度接种于6孔板，根据Lipofectamine 2000试剂说明书的步骤，将miR-NC、miR-135b-5p、anti-miR-NC、anti-miR-135b-5p、pcDNA、pcDNA-ANGPTL2转染到软骨细胞。根据不同的实验目的，使用10 ng/ml IL-1β处理软骨细胞48 h[11]，记为IL-1β组，同时以未经任何处理的软骨细胞设为对照(Con组)。并使用10 ng/ml IL-1β处理转染后的软骨细胞48 h。处理结束后，收集细胞用于各项指标检测。

1.4 qPCR检测miR-135b-5p和ANGPTL2 mRNA表达 在软骨细胞中加入TRIzol试剂提取总RNA，按照逆转录试剂盒的说明合成cDNA，以制成的cDNA为模板，进行qPCR反应。miR-135b-5p上游引物序列为：5’-GGTATGGCTTTTCATTCCT-3’，下游引物序列为：5’-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3’。内参U6上游引物序列为：5’-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3’，下游引物序列为：5’-GGAACGCTTCACGAATTTG-3’。ANGPTL2上游引物序列为：5’-GCCATCTGCGTCAACTCCAAGG-3’，下游引物序列为：5’-CTCACAATGCCGCCGTCCAC-3’。内参GAPDH上游引物序列为：5’-ACCCAGAAGACTGTGGATGG-3’，下游引物序列为：5’-TTCAGCTCAGGGATGACCTT-3’。根据2-ΔΔCt法进行miR-135b-5p和ANGPTL2的量化。

1.5 ELISA法检测IL-6、TNF-α、IFN-γ水平 收集各组软骨细胞上清液，按照ELISA试剂盒说明书的步骤，检测IL-6、TNF-α、IFN-γ水平。

1.6 流式细胞术检测细胞凋亡 收集5×104个软骨细胞，离心后弃去上清液，加入195 μl Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞，加入5 μl Annexin V-FITC，轻轻混匀，加入10 μl碘化丙啶(Propidium iodide，PI)染色液，轻轻混匀，室温避光孵育20 min，上流式细胞仪检测软骨细胞凋亡。

1.7 Western blot检测ANGPTL2、Bcl-2、Bax蛋白表达 以RIPA裂解液从软骨细胞中提取总蛋白，20 μg蛋白经过12% 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳后转移到聚偏二氟乙烯膜，转膜完成后用5%脱脂牛奶封闭1 h，与ANGPTL2、Bcl-2、Bax蛋白一抗(1∶1 000)4℃孵育过夜，与辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶2 000)室温孵育1 h，增强化学发光液显色，GAPDH为内参照，计算ANGPTL2、Bcl-2、Bax蛋白表达。

1.8 双荧光素酶报告实验 Targetscan(http://www.targetscan.org/)预测发现，miR-135b-5p与ANGPTL2 3’非编码区(3’untranslated region,3’UTR)部分碱基可形成互补配对。为证实miR-135b-5p与ANGPTL2是否存在靶向关系，分别构建包含miR-135b-5p结合位点的野生型ANGPTL2(WT-ANGPTL2)和突变型ANGPTL2(MUT-ANGPTL2)3’UTR荧光素酶报告基因质粒，利用Lipofectamine 2000试剂将miR-NC、miR-135b-5p与WT-ANGPTL2或MUT-ANGPTL2共转染，使用双荧光素酶报告系统测定转染48 h后的荧光素酶活性。

2 结果

2.1 miR-135b-5p和ANGPTL2在IL-1β诱导软骨细胞损伤中的表达 qPCR和Western blot检测结果显示，与Con组比较，IL-1β诱导的软骨细胞中miR-135b-5p表达量明显减少，ANGPTL2 mRNA和ANGPTL2蛋白表达量显著增加(P<0.05)。见图1，表1。

图1 ANGPTL2蛋白表达

表1 miR-135b-5p和ANGPTL2在IL-1β诱导软骨细胞损伤中的表达

2.2 miR-135b-5p过表达对IL-1β诱导软骨细胞炎症因子表达的影响 qPCR检测数据表明，与Con组比较，IL-1β诱导的软骨细胞中miR-135b-5p表达量明显减少；与IL-1β+miR-NC组比较，IL-1β+miR-135b-5p组软骨细胞中miR-135b-5p表达量显著增加(P<0.05)。ELISA检测结果发现，与Con组比较，IL-1β诱导的软骨细胞内IL-6、TNF-α、IFN-γ水平明显升高；与IL-1β+miR-NC组比较，IL-1β+miR-135b-5p组软骨细胞的IL-6、TNF-α、IFN-γ水平显著降低(P<0.05)。见表2。

表2 miR-135b-5p过表达对IL-1β诱导软骨细胞炎症因子表达的影响

2.3 miR-135b-5p过表达对IL-1β诱导软骨细胞凋亡的影响 流式细胞术检测结果发现，与Con组比较，IL-1β诱导的软骨细胞凋亡率大幅增加；与IL-1β+miR-NC组比较，IL-1β+miR-135b-5p组软骨细胞凋亡率显著降低(P<0.05)。Western blot检测结果显示，与Con组比较，IL-1β诱导的软骨细胞Bcl-2蛋白表达量明显减少，Bax蛋白水平显著提高；与IL-1β+miR-NC组比较，IL-1β+miR-135b-5p组软骨细胞Bcl-2蛋白表达量明显增加，Bax蛋白水平显著降低(P<0.05)。见表3，图2。

图2 miR-135b-5p过表达对IL-1β诱导软骨细胞凋亡的影响

表3 miR-135b-5p过表达对IL-1β诱导软骨细胞凋亡的影响

2.4 miR-135b-5p靶向调控ANGPTL2的表达 Targetscan预测发现，ANGPTL2的3’UTR中含有与miR-135b-5p互补的核苷酸序列。双荧光素酶报告实验结果表明，与miR-NC和WT-ANGPTL2共转染比较，miR-135b-5p和WT-ANGPTL2共转染明显降低荧光素酶活性(P<0.05)，与miR-NC和MUT-ANGPTL2共转染比较，miR-135b-5p和MUT-ANGPTL2共转染的荧光素酶活性无明显变化。与miR-NC组比较，miR-135b-5p明显减少ANGPTL2蛋白表达量，与anti-miR-NC组比较，anti-miR-135b-5p显著提高ANGPTL2蛋白水平(P<0.05)。见图3，表4、5。

表4 双荧光素酶报告实验

图3 miR-135b-5p靶向调控ANGPTL2的表达；A ANGPTL2的3’UTR中含有与miR-135b-5p互补的核苷酸序列；B ANGPTL2蛋白表达

表5 miR-135b-5p调控ANGPTL2蛋白的表达

2.5 ANGPTL2过表达逆转了miR-135b-5p过表达对IL-1β诱导软骨细胞损伤的影响 与IL-1β+miR-NC组比较，IL-1β+miR-135b-5p组软骨细胞ANGPTL2蛋白表达量、IL-6、TNF-α、IFN-γ水平、凋亡率、Bax蛋白表达量明显降低，Bcl-2蛋白水平显著升高(P<0.05)。与IL-1β+miR-135b-5p+pcDNA组比较，IL-1β+miR-135b-5p+pcDNA-ANGPTL2组软骨细胞中ANGPTL2蛋白、IL-6、TNF-α、IFN-γ水平、凋亡率、Bax蛋白水平明显提高，Bcl-2蛋白表达量显著减少(P<0.05)。见图4,表6。

图4 ANGPTL2过表达逆转了miR-135b-5p过表达对IL-1β诱导软骨细胞凋亡的影响；A ANGPTL2和凋亡相关蛋白表达；B 细胞凋亡流式图

表6 ANGPTL2过表达逆转了miR-135b-5p过表达对IL-1β诱导软骨细胞损伤的影响

3 讨论

骨关节炎是一种严重影响老年人健康的退行性关节疾病，主要临床表现为关节反复疼痛和关节运动障碍逐渐加重，严重危害中老年人群的身体健康，影响患者的生活质量，给个人、家庭甚至社会带来沉重的负担[12]。临床上，骨关节炎的主要治疗方法是缓解关节疼痛，维持或改善关节的生理功能，保护关节的组织结构。然而，目前的效果并不令人满意。为了识别减轻症状和预防残疾的新治疗靶标，需要进一步研究以了解骨关节炎的发病机理。

软骨内稳态对于关节功能至关重要，在骨关节炎进展中，软骨内稳态会趋向于破坏[13]。软骨细胞通过调节软骨基质合成与降解的平衡，被证实是维持软骨完整性的关键参与者。炎性细胞因子通常导致细胞功能障碍，尤其是在软骨细胞中。软骨细胞可通过分泌炎性因子来促进软骨降解。炎症因子可以多种方式刺激级联反应，不断刺激软骨细胞分泌细胞因子，进而触发骨关节炎[14]。IL-1β是一关键的促炎因子，是骨关节炎的介质之一[15]。既往研究表明，IL-1β刺激关节正常的软骨细胞可模拟骨关节炎软骨细胞[16]。本研究同样利用IL-1β复制骨关节炎软骨细胞损伤模型，发现IL-1β会促进软骨细胞凋亡和炎性反应，引起软骨细胞损伤。miR-135b-5p可以保护IL-1β诱导的软骨细胞损伤，为骨关节炎的防治提供了一个有吸引力的靶点。

微小RNA(microRNA，miRNA/miR)是一类内源性的小非编码RNA，长度为18～22个核苷酸。miRNA的主要作用是通过翻译抑制和(或)靶mRNA降解来调控靶基因。miRNA负调节基因表达，并且已显示在随着年龄增长的软骨细胞发育和软骨稳态中都起着关键作用，许多miRNA通过信号传导途径，凋亡，自噬和衰老在软骨细胞表型中发挥作用[17]，可作为骨关节炎有前景的生物标志物。miR-135b-5p是其中一种miRNA，除了参与胰腺癌[18]、乳腺癌[19]、卵巢癌[20]、胃癌[21]等癌症进展，还可以保护神经细胞损伤[6]。miR-135b-5p可抑制脂多糖(Lipopolysaccharid，LPS)诱导的巨噬细胞中TNF-α和ROS的产生[22]。但miR-135b-5p在骨关节炎中的生物学功能尚未可知。本研究中，miR-135b-5p表达在IL-1β诱导的软骨细胞中明显下调，miR-135b-5p过表达明显降低IL-1β诱导的软骨细胞IL-6、TNF-α、IFN-γ水平、凋亡率、Bax蛋白表达量，显著提高Bcl-2蛋白水平，说明miR-135b-5p对IL-1β诱导软骨细胞损伤具有保护作用，能够减轻细胞凋亡和炎性反应，与前人研究[6,22]相符。

研究表明，某些miRNA可以直接靶向与骨关节炎的发病机制和发育有关的不同基因，并且在调节软骨细胞的活性和功能中起着至关重要的作用，如miR-20靶向IκBβ影响LPS诱导的软骨细胞促炎细胞因子的产生和细胞凋亡[23]，miR-34a靶向调控TGIF2诱导骨关节炎滑膜细胞凋亡[24]，miR-33b-3p靶向DNA甲基转移酶3(DNA methyltransferase 3A，DNMT3A)促进IL-1β诱导的软骨细胞增殖，抑制软骨细胞凋亡和软骨细胞外基质降解[25]。因此，明确骨关节炎所涉及的miRNA调控网络，了解其作用机制，有助于为骨关节炎的防治提供新的治疗策略。本实验中，IL-1β诱导的软骨细胞中ANGPTL2 mRNA、ANGPTL2蛋白表达显著升高，提示ANGPTL2参与IL-1β诱导的软骨细胞损伤过程。为了进一步探索miR-135b-5p保护IL-1β诱导软骨细胞损伤的作用机制，利用生物信息学预测miR-135b-5p的靶基因，发现miR-135b-5p与ANGPTL2的3’UTR具有靶向结合位点。双荧光酶素实验证实miR-135b-5p靶向调控ANGPTL2的表达。并且，上调miR-135b-5p的表达显著抑制ANGPTL2表达，下调时则相反。ANGPTL2过表达逆转了miR-135b-5p过表达对IL-1β损伤的软骨细胞凋亡、IL-6、TNF-α、IFN-γ水平、Bax蛋白表达的抑制作用，和对Bcl-2蛋白表达的促进作用。这些结果表明，靶向调控ANGPTL2表达可能是miR-135b-5p保护IL-1β诱导的软骨细胞损伤的重要途径之一。

综上所述，miR-135b-5p在IL-1β诱导的软骨细胞中表达下调，其过表达明显抑制IL-1β损伤的软骨细胞凋亡和炎性反应，发挥保护作用，其作用机制与靶向调控ANGPTL2表达有关，这为骨关节炎的预防和干预提供了新的线索。