基于Notch信号通路研究银杏内酯B对非酒精性脂肪肝病的影响

余 虹，武俊紫，宋 波*，李 军

1攀枝花市第二人民医院，四川 攀枝花617068；

2云南中医药大学基础医学院，云南 昆明650504；

3昆明医科大学附属第二人民医院，云南 昆明650500

非酒精性脂肪肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一种临床较为常见的肝脏疾病。相关流行病学研究结果显示，NAFLD发生率逐年升高，在我国城市地区高达24%，农村地区高达12%，其发生率已超过病毒性肝炎，成为我国人群发生率最高的肝脏疾病［1-2］。本病危害较大，控制不佳可引发脂肪性肝炎、肝纤维化、肝硬化甚至肝癌等，因此需早期进行干预，抑制疾病进展是目前临床急需解决的问题之一［3-4］。目前西医对于NAFLD的治疗主要以降脂为主，代表性药物为辛伐他汀，虽疗效尚可，但副作用较大［5］。中医药治疗NAFLD有其独特优势，治疗药物根据患者不同证候选择，主要有柴胡舒肝丸、安络化纤丸、双虎清肝颗粒以及逍遥丸等［6］，但由于其药理成分复杂，中药复方在国际推广上较难。银杏内酯B是具有活血化瘀作用的单体药，其在改善脂质代谢方面具有较好的效果［7］，且副作用少，安全性高。有研究发现，Notch基因过量表达与肝脏脂质积累具有相关性，许多研究以Notch基因为靶点治疗NAFLD效果较好［8］。有研究显示，银杏内酯B的作用靶点之一为Notch信号通路［9-10］，为此本研究基于Notch信号通路研究银杏内酯B干预NAFLD大鼠模型，以期为银杏内酯B治疗NAFLD提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选择SPF级雄性SD大鼠72只，5～6周龄，体质量为160～180 g，由昆明医科大学动物实验中心提供［合格证号：SCXK（滇）K2015-0002］，大鼠购买后饲养于标准动物饲养房，日常饮食和清洁由专业人员统一负责，饲养环境温度和湿度均由中央空调统一控制，温度22～27℃，湿度40%～60%，光照／黑暗：12 h／12 h。

1.2 主要试剂与仪器

TGF-β1试剂盒（上海酶联生物科技有限公司）；TNF-α试剂盒（武汉谷歌生物科技公司）；二抗（艾美捷科技有限公司）；引物（武汉谷歌生物科技有限公司）；电子天平（上海精密仪器仪表有限公司，FA1204B型）；pH计（山东德天环保设备有限公司，PH-03型）；超低温冰箱（美国Thermo Forma公司，725型）；低温高速离心机（上海卢湘仪离心机仪器有限公司，TGL-16.5M型）；紫外-可见分光光度计（上海精密仪器仪表有限公司，UV-8000型）；蛋白电泳仪（Bio-Rad Mini-PROTEAN美国伯乐公司，Tetra Cell型）；实时荧光定量PCR仪（赛默飞世尔科技公司，QuantStudioTM3 System型）；谷草转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、谷丙转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、高密度脂蛋白试剂盒（high-density lipoprotein，HDL-C）和低密度脂蛋白试剂盒（low-density lipoprotein，LDL-C）（南京建成生物工程研究所）；Notch-3、Hes-1和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗体（美国Santa Cruz公司）。

1.3 模型制备与评估

1.3.1 非酒精性脂肪肝病模型建立 所有大鼠购买后先适应性喂养2周，随机选取12只作为正常组，给予普通饲料（昆明医科大学动物实验部提供）喂养；其余60只大鼠为实验组，给予高脂高糖饲料（主要配方：83.25%基础饲料、10%猪油、5%蔗糖、1.5%胆固醇和0.25%胆酸钠）喂养12周，不做其他特殊处理。

1.3.2 非酒精性脂肪肝病模型评估 喂养12周后，正常组随机选择2只，实验组随机选择10只处死，收集肝脏组织进行病理学检测，判断是否造模成功，造模成功的标准为肝脏HE染色有明显大量脂肪空泡［11］。当随机处死的大鼠大部分都有脂肪肝病时即可认为造模成功［12］。

1.4 实验分组与给药

1.4.1 实验分组 造模成功的50只大鼠按照随机数字表法分为模型组、辛伐他汀组、低剂量组、中剂量组和高剂量组，每组10只，造模成功后所有组别均停用高脂饲料，给予普通饲料喂养。

1.4.2 给药 给药剂量参照“人和动物体表面积折算的等效剂量比率表”进行换算［13］。正常组、模型组均按1 mL／d剂量给予生理盐水灌胃；辛伐他汀组按2 mg／（kg·d）剂量给予辛伐他汀（北京福元医药股份有限公司，生产批号：20180807）灌胃；低剂量组按0.5 mg／（kg·d）剂量给予98%银杏内酯B（成都德思特生物技术有限公司，生产批号：170315）灌胃；中剂量组按1.0 mg／（kg·d）剂量给予98%银杏内酯B灌胃；高剂量组按2.0 mg／（kg·d）剂量给予98%银杏内酯B灌胃。每次灌胃前均给予大鼠称重，尽最大可能保证给药量准确。灌胃时，分别将辛伐他汀、银杏内酯B溶解于1 mL生理盐水中。治疗时间为4周。

1.5 取材及样本处理

1.5.1 取材前准备 所有大鼠均于最后1次灌胃结束后当天20:00～24:00分批次禁食不禁水12 h，次日依照批次麻醉后取材。

1.5.2 血液样本采集 采用戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，麻醉后将其固定于解剖板，采用10 mL注射器从腹主动脉抽取血液，血液收集后立即将其置入带有肝素钠的抗凝管中备用。

1.5.3 肝脏样本采集 血液采集后，处死动物，直接取出肝脏组织，将其切成3份，1份置入组织固定液用于病理学检测，1份置入RNA保存液中用于相对应RNA检测，最后1份置入超低温冰箱中用于蛋白表达的检测。

1.6 指标及检测方法

1.6.1 生化指标检测 采用分光光度法检测血浆中AST、ALT、LDL-C和HDL-C等生化指标；采用ELISA法检测血浆和肝脏组织中转化生长因子－β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等生化指标。血液生化指标的检测全部按照试剂盒提供的说明书进行；肝脏组织中TGF-β1和TNF-α的测定方法为：称取100 mg肝脏组织，用总蛋白试剂盒提取总蛋白，采用BCA法定量并调平后，严格按照试剂盒说明书进行测定。

1.6.2 HE染色方法观察肝脏组织病理学 肝脏组织采用生理盐水洗涤后，将其用石蜡包埋、切片（3～5μm）、脱蜡、酒精脱水、苏木精和伊红染色（HE染色），完成后将切片固定于载玻片上，中性树脂封片，采用普通光学显微镜进行图像采集，每张切片选取5个不同的视野。NAFLD病理评价采用分级分析法，①0级：0分，脂肪变性细胞＜5%；②1级：1分，肝脏脂肪变性细胞占5%～33%；③2级：2分，肝脏脂肪变性细胞占34%～66%；④3级：3分，肝脏脂肪变性细胞＞67%。

1.6.3 实时荧光定量PCR法检测肝脏组织中Notch-3和Hes-1 mRNA表达 称取20 mg肝脏组织，用总RNA试剂盒提取总RNA后，定量后每组各取2μg逆转录为cDNA，后行扩增反应，扩增条件为：94℃预变性5 min，95℃变性15 s，56℃退火15 s，72℃延伸30 s，共进行34个循环，结果采用2－△△Ct法比较分析。引物序列：Notch-3上游引物为5"-AGTGCCGATCTGGTACAACTT-3"；下游引物为5"-CACTACGGGGTTCTCACACA-3"，产物长度为116 bp；Hes-1上游引物为5"-TCAGCGAGTGCATGA ACGAG-3"，下游引物为5"-CATGGCGTTGATCTGG GTCA-3"，产物长度为119 bp；GAPDH上游引物为5"-GGACTAGCTACTGACCC-TC-3"，下游引物为5"-TACCCTGGCTCTTTGAT-3，产物长度为117 bp。

1.6.4 Western blot法检测肝脏组织中Notch-3和Hes-1蛋白表达 称取100 mg肝脏组织，用总蛋白试剂盒提取总蛋白后，BCA法定量并调平，然后每组各取50μg行SDS-PAGE凝胶电泳，电泳完成后半干转移法将其转移到PVDF膜，转膜完成后采用5%脱脂牛奶封闭2 h，2 h后取出加入一抗过夜，次日取出后加入二抗封闭30 min后取出，洗涤3次后加入发光液曝光洗片。以所测蛋白的灰度值／GAPDH的灰度值作为所测蛋白的相对表达量。

1.7 统计学方法

采用SPSS 23.0统计学软件进行统计分析。计量资料服从正态分布，数据采用（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD－t检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 干预后6组生化指标比较

见表1。

2.2 HE染色方法检测肝脏组织病理学结果

组织病理学可见，正常组大鼠肝细胞大小基本均一，细胞核分布相对均匀，切片表面也光滑，几乎没有脂肪空泡出现［脂肪变性细胞仅为（0.64±0.12）%］；而模型组则出现有大量脂肪空泡，同时细胞核受到挤压分布于细胞膜表面［肝脏脂肪变性细胞占到整个肝脏细胞（72.25±18.45）%］；与模型组比较，辛伐他汀组，高、中、低剂量组脂肪空泡数量明显降低（辛伐他汀组和银杏内酯B中剂量组和高剂量组肝脏脂肪变性细胞占5%～33%，银杏内酯B低剂量组肝脏脂肪变性细胞占34%～66%），这提示肝脏脂肪浸润有明显改善。见图1和表2。

2.3 Western blot法和实时荧光定量PCR法检测肝脏组织Notch-3、Hes-1蛋白和mRNA表达结果

见图2、表3。

3 讨 论

3.1 银杏内酯B可有效改善NAFLD大鼠肝功能和调节血脂

祖国传统医学对肝病有诸多描述，但却没有脂肪肝病的概念。根据现代医学有关于“脂肪肝”的病理特征描述，结合中医相关脉象，中医学将其归属“胁痛”“痞满”“积聚”“瘀血”等病证范畴［14-15］。中医学认为脂肪肝病病位主要在肝、脾，以痰、浊、血、瘀、酒、毒为基本病理因素，病性为本虚标实，气滞痰郁，瘀湿蕴聚肝脏而致本病［14］。治疗原则主要有“清热解毒”“除湿清热”“活血化瘀”等，其中以“化瘀”为主要核心。银杏内酯B是银杏的提取物之一，是血小板活化因子拮抗剂，也是常用的化瘀药，具有化瘀、降痰及解毒的功效［16-17］。

表1 6组干预后生化指标比较（±s）Table 1 Comparison of biochemical indicators in six groups after intervention（±s）

表1 6组干预后生化指标比较（±s）Table 1 Comparison of biochemical indicators in six groups after intervention（±s）

注：与正常组比较，1）P＜0.05；与模型组比较，2）P＜0.05；与辛伐他汀组比较，3）P＜0.05。Note:Compared with the normal group,1)P＜0.05;Compared with the model group,2)P＜0.05;Compared with the simvastatin group,3)P＜0.05.

组别正常组模型组辛伐他汀组低剂量组中剂量组高剂量组n 10 10 10 10 10 10 AST／（U／L）66.23±6.92 160.78±25.161）78.15±15.212）80.21±12.852）77.69±9.152）75.43±6.182）ALT／（U／L）38.28±4.19 65.78±9.041）45.77±5.172）48.16±6.382）44.38±4.372）44.08±3.982）HDL-C／（mmol／L）3.80±0.50 4.26±0.461）4.23±0.58 4.30±0.45 4.34±0.46 4.35±0.34 LDL-C／（mmol／L）0.26±0.05 1.36±0.351）0.57±0.262）0.60±0.302）0.56±0.292）0.50±0.152）组别正常组模型组辛伐他汀组低剂量组中剂量组高剂量组n TGF-β1／（μg／mL）TNF-α／（mmol／L）10 10 10 10 10 10血液0.73±0.09 1.23±0.141）0.91±0.082）0.82±0.102）3）0.83±0.112）3）0.79±0.082）3）肝脏1.10±0.12 1.89±0.291）1.45±0.122）1.30±0.132）3）1.31±0.122）3）1.27±0.112）3）血液0.73±0.14 1.46±0.291）0.92±0.182）0.80±0.312）3）0.85±0.162）3）0.84±0.142）3）肝脏2.35±0.44 5.37±1.061）3.04±0.652）2.65±0.712）3）2.63±0.472）3）2.71±0.582）3）

图1 大鼠肝脏HE染色图（×200）Figure1 HE staining of rat liver（×200）

本研究结果显示，正常组肝细胞切片HE染色表面光滑，没有脂肪颗粒浸润，而模型组则出现大量的脂肪空泡，银杏内酯B高、中、低剂量组干预后脂肪空泡数量明显降低。此外，与模型组比较，高、中、低剂量组干预后AST、ALT均明显降低，血脂LDL-C和肝脏炎症因子TGF-β1、TNF-α也均明显降低。这提示，银杏内酯B可有效改善NAFLD大鼠肝功能，调节血脂水平和降低炎症反应。这与龙思琴等［18-19］研究结果一致。

肝脏是代谢糖、脂的主要器官，当人体摄入过多糖、脂后，肝脏不能将其完全代谢，可造成脂肪颗粒蓄积于肝脏，积累到一定程度形成脂肪肝病。通过肝脏病理学可见肝脏有明显的脂肪空泡［20］。本研究采用银杏内酯B干预NAFLD大鼠，血浆LDL-C和血脂水平明显降低，可有效促进肝脏脂肪颗粒代谢向外排出，NAFLD大鼠肝脏脂肪空泡数量明显减少，肝脏炎症反应降低，肝脏功能逐步恢复正常。

表2 6组肝脏组织病理学评分比较（±s）Table 2 Comparison of the Liver histopathological score in six groups（±s）

表2 6组肝脏组织病理学评分比较（±s）Table 2 Comparison of the Liver histopathological score in six groups（±s）

注：与正常组比较，1）P＜0.05；与模型组比较，2）P＜0.05。Note:Compared with the normal group,1)P＜0.05;Compared with the model group,2)P＜0.05.

评分／分0.00±0.00 2.98±0.271）1.44±0.132）1.98±0.092）1.72±0.152）1.46±0.122）组别正常组模型组辛伐他汀组低剂量组中剂量组高剂量组n 10 10 10 10 10 10脂肪变性细胞占肝细胞百分比／%0.64±0.12 72.25±18.451）16.87±2.142）42.56±5.782）25.37±4.142）14.28±3.182）

图2 大鼠肝脏Notch-3和Hes-1蛋白表达图Figure 2 Expression of Notch-3 and Hes-1 proteins in rat liver

表3 6组干预后肝脏组织Notch-3和Hes-1蛋白及mRNA比较（±s）Table 3 Comparison of Notch-3，Hes-1 proteins and mRNA of liver tissues in six groups after intervention（±s）

表3 6组干预后肝脏组织Notch-3和Hes-1蛋白及mRNA比较（±s）Table 3 Comparison of Notch-3，Hes-1 proteins and mRNA of liver tissues in six groups after intervention（±s）

注：与正常组比较，1）P＜0.05；与模型组比较，2）P＜0.05；与辛伐他汀组比较，3）P＜0.05。Note:Compared with the normal group,1)P＜0.05;Compared with the model group,2)P＜0.05;Compared with the simvastatin group,3)P＜0.05.

组别正常组模型组辛伐他汀组低剂量组中剂量组高剂量组n Notch-3 Hes-1 10 10 10 10 10 10蛋白0.30±0.02 0.84±0.061）0.61±0.082）0.67±0.062）0.38±0.072）3）0.36±0.082）3）mRNA 1.02±0.01 2.35±0.131）1.68±0.122）1.72±0.132）1.54±0.122）3）1.47±0.112）3）蛋白0.25±0.03 0.76±0.091）0.38±0.062）0.60±0.052）0.38±0.062）3）0.34±0.042）3）mRNA 1.01±0.01 1.95±0.121）1.62±0.132）1.65±0.112）1.53±0.122）3）1.52±0.112）3）

3.2 银杏内酯B改善NAFLD大鼠肝功能可能与调节Notch信号通路有关

Notch基因对细胞生长发育具有重要作用，对肝脏代谢具有独特作用。Notch基因过度表达会导致脂质代谢异常和肥胖等，而这是NAFLD发生、发展的关键因素。Notch蛋白是一类在发育过程中与细胞分化相关的受体蛋白家族成员，其分泌的mRNA转录并活化后通过调节Hes-1蛋白及mRNA表达，上调固醇调节结合蛋白1c（SREBP1c）活性，增强肝细胞内甘油三酯合成，促进NAFLD发生发展［21-23］。本研究结果显示，与正常组比较，模型组Notch-3、Hes-1蛋白及其mRNA表达均明显升高；与模型组比较，中、高剂量银杏内酯B干预后NAFLD大鼠Notch-3、Hes-1蛋白及其mRNA表达明显降低。这提示银杏内酯B改善NAFLD大鼠肝功能可能与调节Notch信号通路有关。银杏内酯B通过调节Notch信号通路，可抑制Notch-3、Hes-1蛋白及其mRNA的表达，调节脂质代谢紊乱，减轻肥胖，从而改善NAFLD症状。这与李腾腾等［23］以Notch信号通路为靶点观察银杏内酯B治疗脑缺血再灌注损伤，发现其可以明显降低Notch蛋白表达的结果相似。

4 小 结

银杏内酯B可改善NAFLD大鼠肝功能，调节血脂水平，降低炎症反应，而这可能与调节Notch信号通路，抑制Notch-3、Hes-1蛋白及其mRNA的表达有关。下调Notch信号可能是治疗NAFLD患者的候选靶标，但还需要进一步研究以证实这个假说，以阐明Notch信号通路与NAFLD之间的关系。