运动预处理对心肌缺血再灌注损伤老龄大鼠心肌的影响

李宏玉，尹 侠，张世强，朱路文，唐 强*

1黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江 哈尔滨150001；

2黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨150040

心肌缺血是冠心病基本的病理、生理过程，尽早恢复缺血心肌的血流灌注能够挽救缺血心肌，显著提高治疗效果；但心肌缺血再灌注损伤（myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI）成为影响冠心病治疗的重要因素。缺血预适应（ischemic preconditioning，IPC）是心肌保护的新概念，是MURRY等［1］于1986年首次提出，是迄今为止最有效的内源性心肌缺血保护方法［2-3］，其通过反复、短暂的缺血／再灌注刺激后，使心肌对之后更长时间缺血缺氧等刺激的耐受性增强，对心肌细胞产生一定的保护作用。有研究显示，运动可以产生IPC样类似的保护效应，运动预处理（exercise preconditioning，EP）作为一种生理性模仿缺血预适应的预处理方式，通过在缺血前进行适宜强度、重复多次的运动干预，可以模拟缺血预处理的模式来增强心脏对缺血、缺氧的耐受能力，引起心肌保护效应［4-6］。这可为防治冠心病提供新思路和新途径，与中医“治未病”的疾病防治准则相一致。流行病学调查发现，运动训练能减少心脏疾病危险因素，降低冠心病的发生率和病死率［7］。因此，本研究通过建立离体心肌缺血／再灌注模型探讨运动预处理诱导老龄大鼠心肌发挥IPC的保护作用机制，为临床应用提供参考。

1 实验材料

1.1 实验动物

选取SPF级雄性SD老龄大鼠75只，鼠龄：15～18个月，体质量（450±20）g，购买于黑龙江中医药大学药物安全性评价中心［动物使用许可证：SYXK（黑）2019002］。饲养环境：通风良好、自由饮水、人工光照12 h／12 h（明暗交替）、温度（21±2）℃、湿度（60±5）%的标准屏障环境。

1.2 主要仪器与试剂

动物实验跑台（徐州利华电子公司，ZH-PT型）；Langendorff离体心脏灌流实验系统（江苏赛昂斯生物技术有限公司）；-80℃超低温冰箱（日本Panasonic公司）；BioNex台式多导生理信号记录仪（美国Mindware公司）；2，3，5-氯化三苯基四氮唑（美国Sigma公司）；无水乙醇（天津市天力化学试剂公司）；多聚甲醛（天津光科密欧有限公司）；肝素钠注射液（天津生物化学制药有限公司，规格：1万U／mL）。

2 实验方法

2.1 动物筛选及分组

采用电动动物实验跑台进行训练，1次／d，共训练3 d。跑台参数如下：①时间：30 min／d；②速度：15 m／min；③坡度：0°；④电击强度：1.0 mA。淘汰标准：1次训练中电击次数＞5次和／或1次电击时间＞1 s的大鼠。跑台训练完成后，淘汰15只大鼠，共纳入60只配合度较高、体质较好的大鼠。按照随机数字表法分为对照组（Con组）、缺血再灌注模型组（IR组）、运动预处理＋缺血再灌注组（EP＋IR组）、缺血预适应组（IPC组）、运动预处理＋缺血预适应组（EP＋IPC组），每组12只。

2.2 干预方法

Con组、IR组、IPC组不做特殊运动干预；EP＋IR组、EP＋IPC组接受运动预处理干预，具体如下：采用电动动物实验跑台进行梯度运动训练，1次／d，5 d／周，共训练6周。跑台参数如下：①时间：起始15 min／d，每3 d时间增加5 min／d，直至时间增至60 min／d时不再变化；②速度：20 m／min；③坡度：0°；④电击强度：1.0 mA。

2.3 模型制备

选取1%戊巴比妥钠溶液经腹腔注射（40～50 mg／kg）对大鼠进行麻醉［8］，为防止血管凝血选取肝素钠溶液经腹腔注射（100 U／100 g）。麻醉后，将大鼠固定、开胸、迅速取出心脏，用1号线将离体心脏固定在Langendorff离体灌流装置上，采用95%O2和5%CO2混合气体及37℃Krebs-Henseleit（K-H）灌流液恒温恒压灌流，制备老龄大鼠离体心肌缺血再灌注动物模型。

2.3.1 Con组模型 当心脏离体之后，快速主动脉插管进行离体灌流，持续平衡灌注180 min，不参与缺血处置［9-10］。

2.3.2 IR组模型 预灌注平衡20 min，然后保持心脏温度恒定在37℃，通过控制灌流设备的三通阀，使全心缺血40 min后，再复灌120 min。

2.3.3 EP＋IR组模型EP＋IR组大鼠心脏离体后，模型制备方法同IR组。

2.3.4 IPC组模型IPC组大鼠心脏离体后平衡灌注20 min，给予3次缺血预处理（短暂缺血5 min，再灌注10 min），之后缺血40 min，再复灌120 min。

2.3.5 EP＋IPC组模型EP＋IPC组大鼠心脏离体后，模型制备方法同IPC组。

2.4 取材

2.4.1 灌流液取材 各组大鼠在停灌注前（稳定灌注20 min）和再灌注后30、60、120 min时，用2 mL EP管留取1 min心脏灌流液，并用量筒准确测量灌流液体积，随后离心，取上清保存于-20℃冰箱中以备LDH活性检测。

2.4.2 心肌组织取材 各组大鼠离体心脏在灌流结束后取下全心，每组随机选取6只用于心肌梗死面积观察。4℃PBS溶液冲洗心脏表面及内腔血液并用滤纸吸干水分，-20℃冷冻20 min后进行染色。6只大鼠心肌组织用生理盐水洗净，经液氮速冻后，置于－80℃冰箱保存用于超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）及丙二醛（malondialdehyde，MDA）检测。

2.5 观察指标

2.5.1 心脏功能评价 心脏恢复跳动后，连接生物信号采集系统，分别采用以下指标评价大鼠心功能：①停灌注前（稳定灌注20 min）和再灌注后30、60、120 min时的心率（heart rate，HR）；②左心室舒张压（left ventricular developed pressure，LVDP）；③左心室压力最大上升速率（+dp／dtmax）；④左心室压力最大下降速率（-dp／dtmax）。⑤接取1 min心脏灌流液，测定体积及冠脉流量（coronary flow，CF）。

2.5.2 TTC染色法观察各组心肌梗死面积 灌流结束后取材，随后放置于-20℃冰箱冷冻30 min，配制1% TTC染色液后置于37℃恒温箱中避光预热30 min。随后沿心脏纵轴进行组织切片，连续切成厚度约2 mm相同的6片心肌组织。孵育、定色、拍照、用图像分析软件Image Pro Plus 6.0来测定梗死区结果分析，梗死面积用梗死区（苍白区）面积／全心面积（砖红色区＋苍白区）的百分比表示。

2.5.3 比色法检测乳酸脱氢酶活性、心肌组织含量及活力

2.5.3.1 乳酸脱氢酶活性 取再灌注后120 min留取的2 mL灌流液（-80℃保存），按检测试剂盒（可见光比色法）说明书测定灌流液中乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）的活性。

2.5.3.2 心肌组织含量及活力 取出－80℃冰箱保存的心肌组织，分别按照检测试剂盒说明书测定MDA含量及SOD活力。

2.6 统计学方法

采用SPSS 25.0软件进行统计学分析。计量资料符合正态分布，数据以（±s）表示。组间比较采用单因素方差分析，组内不同时间点比较采用重复测量方差分析，两两比较方差齐用LSD-t检验，方差不齐则用Tamhane"s T2检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

3 结 果

3.1 5组心功能比较

见表1。

3.2 5组大鼠心肌梗死面积比较

5组大鼠心肌组织经TTC染色后，非梗死区域呈砖红色，梗死区域呈苍白色。Con组无缺血模型制备，故无梗死面积变化；与Con组比较，IR组心肌梗死面积明显增大（P＜0.05）；与IR组比较，EP＋IR组、IPC组、EP＋IPC组 心 肌 梗 死 面 积 明 显 缩 小（P＜0.05）；与EP＋IR、IPC组比较，EP＋IPC组心肌梗死面积明显更小（P＜0.05）；EP＋IR组和IPC组比较，心肌梗死面积差异无统计学意义（P＞0.05）。见图1、表2。

3.3 5组大鼠LDH活性、MDA含量和SOD活力比较

3.3.1 5组大鼠心脏再灌注120 min灌流液LDH活性水平比较 见表3。

3.3.2 5组大鼠心肌组织MDA含量、SOD活性比较 见表4。

4 讨 论

MIRI是一系列复杂的病理、生理变化，损伤机制具体包括线粒体损伤、细胞凋亡、炎症反应及氧化应激等［11-12］。运动预适应对心肌细胞保护作用的机制较为复杂，目前认为，其主要与运动诱导心肌细胞适应性保护有关。

4.1 运动预处理可以有效改善MIRI老龄大鼠心脏功能

再灌注后心律失常是心肌缺血再灌注损伤的重要表现之一。如何预防或减少心肌缺血再灌注损伤是临床研究的热点之一。本研究结果显示，与IR组比较，EP＋IPC组灌注后HR、LVDP、±dp／dtmax、CF等心功能指标均明显提高，这提示，缺血再灌注前给予一定的运动训练以及缺血预处理能有效提高MIRI老龄大鼠心脏功能。与EP＋IR、IPC组比较，EP＋IPC组灌注后HR、±dp／dtmax、CF均明显升高，这提示，在缺血再灌注前给予一定程度的运动训练，能够有效增强MIRI老龄大鼠心肌缺血预适应诱导的心功能。这与孙华伟［13］研究发现速度递增的跑台训练能明显改善心功能；王立中等［14-15］研究发现冠心病患者及经皮冠状动脉介入治疗术后出院患者，接受适宜强度的运动训练可以增强患者的运动耐力、改善心脏舒张功能，并降低再入院率的结果

相似。但其究竟是如何发挥心脏保护作用的，目前尚未形成统一结论。有研究显示，进行一定强度的EP可以增强心脏IPC的保护效应，通过提高心肌对抗缺血缺氧的耐受程度，诱导改善心脏收缩舒张功能，从而发挥心肌保护作用［16-17］。

表1 5组心脏功能指标比较（±s）Table 1 Comparison of cardiac function indexes in five groups（±s）

注：与Con组同一时间点比较，1）P＜0.05；与IR组同一时间点比较，2）P＜0.05；与EP+IR组同一时间点比较，3）P＜0.05；与IPC组同一时间点比较，4）P＜0.05。Note:Compared with the Con group at the same time,1)P＜0.05;Compared with the IR group at the same time,2)P＜0.05;Compared with the EP+IR group at the same time,3)P＜0.05;Compared with the IPC group at the same time,4)P＜0.05.

+dp／dtmax／（Kpa／s）3 083.5±160.7 2 461.9±92.3 2 317.1±309.6 2 024.2±175.3 2 801.4±161.91）802.0±98.91）782.2±81.71）759.6±170.21）2 919.1±179.0 1 395.6±187.22）1 285.2±242.32）1 302.6±131.32）2 922.3±165.1 1 386.2±169.52）1 302.1±264.92）1 310.2±143.22）3 058.6±130.02）1 791.7±127.42）3）4）1 761.6±286.72）3）4）1 658.7±77.12）3）4）组别n Con组12 IR组12 EP＋IR组12 IPC组12 EP＋IPC组12时间再灌注前再灌注30 min再灌注60 min再灌注120 min再灌注前再灌注30 min再灌注60 min再灌注120 min再灌注前再灌注30 min再灌注60 min再灌注120 min再灌注前再灌注30 min再灌注60 min再灌注120 min再灌注前再灌注30 min再灌注60 min再灌注120 min HR／（次／min）300.2±17.9 256.0±24.8 246.5±14.6 236.6±12.8 277.5±16.21）107.4±16.11）99.9±11.71）106.3±17.51）285.3±19.7 133.4±13.32）119.3±13.72）132.4±17.42）285.8±17.4 136.9±14.72）120.5±12.62）134.2±16.92）284.2±18.2 185.8±16.22）3）4）166.9±18.62）3）4）183.5±21.42）3）4）LVDP／mm Hg 111.4±8.6 78.8±6.6 69.1±8.3 63.8±9.7 98.0±6.61）25.2±11.01）30.2±7.21）25.9±15.21）103.8±7.0 52.5±5.62）53.6±10.02）45.4±7.82）105.3±6.3 54.6±6.12）53.2±12.22）44.6±10.22）113.1±13.42）69.6±11.22）3）4）62.5±12.42）56.9±11.22）-dp／dtmax／（Kpa／s）2 365.2±96.9 1 853.3±220.4 1 827.1±150.7 1 684.2±158.7 2 292.9±172.71）837.4±184.91）801.5±131.91）844.5±95.61）2 315.2±180.3 1 154.6±164.02）1 176.8±155.42）1 211.4±151.32）2 308.1±163.2 1 138.6±163.92）1 169.3±156.32）1 208.3±147.82）2 309.6±182.4 1 578.2±156.72）3）4）1 677.7±76.72）3）4）1 525.5±133.02）3）4）CF／（mL／min）9.4±0.9 7.9±0.5 7.6±0.5 6.4±0.7 9.3±0.41）5.6±0.51）3.8±0.51）3.2±0.91）9.4±0.7 6.8±0.42）5.2±0.52）4.2±1.02）9.3±0.4 6.6±0.32）5.3±0.72）4.1±0.72）9.7±0.8 7.4±0.62）3）4）6.9±0.72）3）4）5.6±0.82）3）4）

图1 5组大鼠心肌梗死面积TTC染色结果Figure 1 TTC staining results in the area of myocardial infarction in five groups

表2 5组大鼠心肌梗死面积比率比较（±s）Table 2 Comparison of myocardial infarction areas ratio（±s）

表2 5组大鼠心肌梗死面积比率比较（±s）Table 2 Comparison of myocardial infarction areas ratio（±s）

注：与Con组比较，1）P＜0.05；与IR组比较，2）P＜0.05；与EP＋IR组比较，3）P＜0.05；与IPC组比较，4）P＜0.05。Note:Compared with the Con group,1)P＜0.05;Compared with the IR group,2)P＜0.05;Compared with the EP+IR group,3)P＜0.05;Compared with the IPC group,4)P＜0.05.

心肌梗死面积比率／%0 24.35±0.491）13.88±0.322）13.91±0.402）10.07±0.172）3）4）组别Con组IR组EP＋IR组IPC组EP＋IPC组n66666

表3 5组大鼠灌流液中LDH活性水平比较（±s）U／LTable 3 Comparison of LDH activity levels in five groups（±s）U／L

表3 5组大鼠灌流液中LDH活性水平比较（±s）U／LTable 3 Comparison of LDH activity levels in five groups（±s）U／L

注：与Con组比较，1）P＜0.05；与IR组比较，2）P＜0.05；与EP＋IR组比较，3）P＜0.05；与IPC组比较，4）P＜0.05。Note:Compared with the Con group,1)P＜0.05;Compared with the IR group,2)P＜0.05;Compared with the EP+IR group,3)P＜0.05;Compared with the IPC group,4)P＜0.05.

组别Con组IR组EP＋IR组IPC组EP＋IPC组n66666 LDH活性51.679±7.410 152.974±14.8301）105.923±13.3132）110.456±13.6132）78.361±16.8042）3）4）

表4 5组大鼠心肌组织MDA含量、SOD活力比较（±s）nmol／mgprotTable 4 Comparison of MDA and SOD content of myocardial tissue in five groups（±s）nmol／mgprot

表4 5组大鼠心肌组织MDA含量、SOD活力比较（±s）nmol／mgprotTable 4 Comparison of MDA and SOD content of myocardial tissue in five groups（±s）nmol／mgprot

注：与Con组比较，1）P＜0.05；与IR组比较，2）P＜0.05；与EP＋IR组比较，3）P＜0.05；与IPC组比较，4）P＜0.05。Note:Compared with the Con group,1)P＜0.05;Compared with the IR group,2)P＜0.05;Compared with the EP+IR group,3)P＜0.05;Compared with the IPC group,4)P＜0.05.

组别Con组IR组EP＋IR组IPC组EP＋IPC组n66666 MDA含量3.498±1.322 7.199±0.9901）5.910±1.090 6.866±1.076 3.706±0.2502）3）4）SOD活力530.278±15.787 414.143±81.4731）437.787±31.574 429.803±49.081 522.346±13.5692）3）4）

4.2 运动预处理可以有效减少MIRI老龄大鼠心肌梗死面积

TTC染色液可与正常心肌组织中的脱氢酶产生反应而呈深红色，但由于梗死心肌组织内脱氢酶活性急剧下降，不能与染色液发生反应，故不会产生变化而呈苍白色。本研究结果显示，与Con组比较，IR组出现明显的苍白色梗区，这直观地从形态学角度验证了本研究MIRI模型制备成功。与IR组比较，EP＋IR组、EP＋IPC组心肌梗死面积明显减小，这提示，在缺血再灌注前给予一定程度的运动训练能够大幅改善心肌损伤程度，缩小心肌梗死面积，达到保护心肌的效果。这与FRASIER等［18-20］研究发现规律的运动训练可以减轻缺血再灌注后心律不齐、心肌顿抑、细胞凋亡以及心脏冠状动脉血管反应异常等情况造成的心肌损伤，缩小心肌梗死面积的结果一致。PARRA等［21-22］研究认为这可能与运动训练可以诱导心肌缺血耐受，提高心肌组织对缺血的预适应，从而减少心肌梗死面积有关。

4.3 运动预处理可提高MIRI老龄大鼠心肌细胞能量代谢及抗氧化能力

本研究结果显示：与EP＋IR、IPC组比较，EP＋IPC组LDH活性水平更低。这提示在缺血再灌注前给予一定程度的运动训练，可以下调MIRI老龄大鼠的LDH含量，从而进一步发挥心肌保护作用。这与郭光明［23］研究发现规律的跑台运动训练可下调大鼠血清中LDH含量的结果一致。LDH是机体能量代谢过程中重要的酶，它广泛存在于心肌组织中，当心肌组织受到破坏发生缺血坏死等情况时，血液中LDH活性水平将激增［24］，LDH活性水平增高将会导致心肌细胞进一步损伤。

此外，本研究结果显示，与IR组比较，EP＋IPC组心肌组织中SOD活力明显升高，MDA含量明显降低。这提示，在缺血再灌注前给予一定程度的运动训练，可以提高心肌抗氧化能力，能更有效地诱导老龄大鼠心肌IPC的心脏保护效应。在心肌抗氧化能力方面，SOD和MDA是反映氧化应激程度的2个重要指标。SOD活力的强弱可以反映机体的抗氧化能力，MDA含量可以反映机体内发生脂质过氧化的程度［25］。缺血再灌注后氧化应激促进了氧化剂的积累，降低了心肌细胞的自由基清除能力，SOD活力弱化、MDA大量增加，导致心肌细胞损伤［26］。本研究IPC组心肌组织MDA含量、SOD活力较IR组无明显差异，这提示老龄大鼠心肌IPC诱导心肌缺血耐受的敏感性不足。而与EP＋IR、IPC组比较，EP＋IPC组心肌组织中MDA含量明显降低，SOD活力明显升高，这提示，在缺血前进行运动干预可以使机体产生抗氧化能力的适应，使机体产生适量的自由基刺激抗氧化酶的活性，促进机体SOD活力提高，降低MDA含量，从而上调机体抗氧化水平［27］。

5 小 结

运动预处理可诱导老龄大鼠心肌IPC保护作用，改善老龄大鼠心脏功能，减小心肌梗死面积，减轻心肌细胞损伤。运动预处理对缺血再灌注损伤心肌具有保护作用，可能与其降低心肌缺血再灌注时心肌LDH活性、MDA含量，提高SOD活力，增强心肌抗氧化能力有关。