室内药效试验方法的比较

王桂清　马迪

摘要：为比较室内药效的不同测定方法，在实验室内活体和离体条件下，采用菌片接种法测定不同化学药剂（500 g/L 异菌脲悬浮剂、50%福美双可湿性粉剂、50%啶酰菌胺水分散粒剂、70%甲基硫菌灵可湿性粉剂）对黄瓜灰霉病的保护作用和治疗作用，在含药培养基上，采用菌丝生长速率法测定不同化学药剂对黄瓜灰霉病菌菌丝生长的抑制作用。结果表明，化学药剂的活体效果优于离体效果，但离体条件下的药效趋势与活体条件下的药效趋势一致，说明可用离体试验代替活体试验；化学药剂在培养基上的效果优于在寄主组织上的药效，但利用寄主组织进行药效试验与田间药效试验更近了一步，准确度更高，说服力更强。

关键词：室内药效；试验方法；活体；离体；生长速率法；黄瓜灰霉病

中图分类号： S481+.9 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2017）19-0175-04

收稿日期：2016-05-17

基金项目：山东省自然科学基金（编号：Y2008D57）；山东省自然科学基金联合专项（编号：ZR2012CL17）。

作者简介：王桂清（1968—），女，河北沧州人，博士，教授，主要从事植物保护的教学与科研工作。E-mail：wangguiqing@lcu.edu.cn。 农药的药效指药剂施用后对控制目标（有害生物）的作用效果，是衡量效力大小的指标之一。杀菌剂的药效多用病情指数的降低及受害率降低的百分率来表示。药效的测定，一般先经室内毒力试验证明有效后，再进行田间小区试验。农药室内毒力测定是指在室内进行的农药测定，优点是可以通过大量培养与饲育获得较为均匀一致的供试生物，便于同时进行大量试验，在较短时间内可以得出结果。但由于室内室外环境条件差异较大，因此其结果仅能为田间药效试验提供依据。为探讨室内药效的测定方法，本试验以4种化学药剂为材料，以黄瓜灰霉病菌灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）為靶标，采用活体植物及离体叶片接种法和生长速率法，测定不同药剂对黄瓜灰霉病的保护作用和治疗作用、对病菌菌丝生长的抑制作用，并对室内药效的测定方法进行了比较。

1 材料与方法

1.1 供试病菌及培养

引起黄瓜灰霉病的灰葡萄孢菌，由聊城大学植物病理学研究室提供，采用PDA培养基，于（22±1） ℃恒温培养箱中培养5 d，备用。

1.2 供试药剂及配制

500 g/L异菌脲悬浮剂（拜耳作物科学有限公司），50%福美双可湿性粉剂（青岛好利特生物农药有限公司），50%啶酰菌胺水分散粒剂（德国巴斯夫公司），70%甲基硫菌灵可湿性粉剂（新沂丰乐化工有限公司），配制成800 mg/L母液，备用。保护与治疗作用试验的终浓度为25、50、100、200、400 mg/L，菌丝生长速率试验的终浓度为12.5、25.0、50.0、100.0、200.0 mg/L。

1.3 保护与治疗作用

1.3.1 试验时间和地点 试验于2015年7月至12月在聊城大学农学院生态温室和植物病理学研究室进行。

1.3.2 黄瓜幼苗的种植与管理 供试黄瓜种子为津研4号（山东济南大江种子有限公司）。将种子用温水浸种24 h后，种在质地均匀的营养土中，1钵1株，放于温室中（30 ℃、40%湿度）培养至4张真叶期。保证黄瓜幼苗健壮，及时浇水，正常管理，病株和弱株及时清除。

1.3.3 接种与调查 接种：采用菌饼法接种，待黄瓜长至4张真叶期时进行接种。用直径为0.5 cm的打孔器将培养5 d的灰葡萄孢菌平板打制成菌饼，以备接种用。

活体防效：直接在黄瓜苗上进行，保证叶片大小和叶位一致，1株1叶。保护作用：先向内加少量吐温-20药剂均匀喷于叶片表面，1 mL/叶，待药液阴干，8 h后接种于叶正面，1叶2点，5次重复，无菌水对照；治疗作用：接种8 h后喷药。接种后的黄瓜苗放入温度为（22±1） ℃、湿度大于90%的恒温培养箱中生长，接种后3 d内注意保湿，以后正常管理。

离体防效：采摘大小、叶位一致的黄瓜叶片，叶柄用棉球保湿，叶正面向上放于铺有湿滤纸的直径为14 cm的培养皿中。保护作用、治疗作用的接种方法和管理方法同上，5次重复，无菌水对照。

调查：活体接种5 d、离体接种3 d后调查发病情况，测量其病斑直径（十字交叉法），计算抑制率。

病斑直径（cm）=2次测量平均值（cm）-菌饼直径（cm）。

抑制率=对照病斑直径（cm）-处理病斑直径（cm）对照病斑直径（cm）×100%。

1.4 菌丝生长的抑制作用

以生长速率法（琼胶平板法）[1]测定化学药剂对黄瓜灰霉病菌菌丝生长的抑制作用，所用培养基为PDA培养基，药剂终浓度分别为200.0、100.0、50.0、25.0、12.5 mg/L，以无菌水为对照。菌饼直径为0.5 cm，每皿1块，3次重复，（21±1） ℃ 光照培养箱中培养。待对照菌落直径在3 cm以上时，用十字交叉法测量菌落直径。根据菌落直径求抑制生长的百分率，公式如下：

菌落直径（cm）=2次测量平均值（cm）-菌饼直径（cm）。

菌丝生长抑制率=对照菌落直径（cm）-处理菌落直径（cm）对照菌落直径（cm）×100%。

1.5 毒力回归曲线的建立

取不同的化学药剂，按试验要求配制系列浓度。试验重复3次，建立毒力回归方程。将抑菌的百分率转换成概率值，浓度转换成对数，进行概率值分析，求出不同药剂对病原菌的抑制中浓度（EC50）。

1.6 数据分析

试验数据采用Excel软件进行数据整理，经DPSv 7.01统计软件进行方差分析，线性回归等由SPSS 13.0完成。endprint

2 结果与分析

2.1 4种药剂对黄瓜灰霉病的活体药效

2.1.1 4种药剂对黄瓜灰霉病的活体保护作用 室内利用黄瓜幼苗测定4种化学农药对灰葡萄孢菌引起的黄瓜灰霉病的保护作用，接种5 d后，各药剂的抑菌率见图1，抑菌中浓度（EC50）见表1。

由图1、表1可以看出，在活体条件下各种药剂对黄瓜灰霉病均表现出较好的保护作用，且随着药剂浓度的升高药效逐渐增强。图1表明，异菌脲的保护作用最强，供试浓度下药效均为最好，其次为福美双；当药剂浓度为200 mg/L时，仅有异菌脲的药效超过50.00%，为53.21%；当浓度为 400 mg/L 时，4种供试化学农药的药效均超过50.00%，异菌脲的药效已达到64.98%，福美双的接近60.00%，为59.34%。从表1可以看出，异菌脲、福美双、啶酰菌胺和甲基硫菌灵4种化学农药的EC50分别为150.74、220.20、345.05、378.39 mg/L，即4种农药的药效依次降低。

2.1.2 4种药剂对黄瓜灰霉病的活体治疗作用 接种5 d后治疗作用的抑菌率见图2，EC50见表2。活体条件下各种药剂对黄瓜灰霉病均有治疗作用，且随着药剂浓度的增加药效提高。图2表明，供试浓度下4种供试药剂异菌脲、福美双、啶酰菌胺、甲基硫菌灵的药效依次降低。由表2可见，异菌脲、福美双、啶酰菌胺、甲基硫菌灵的EC50依次为144.02、26319、361.20、458.64 mg/L，说明异菌脲的治疗作用最好。

2.2 4种药剂对黄瓜灰霉病的离体药效

2.2.1 4种药剂对黄瓜灰霉病的离体保护作用 在实验室内离体条件下利用黄瓜叶片测定4种化学药剂对黄瓜灰霉病的保护作用，接种3 d后的效果见图3、表3。

由图3可以看出，离体条件下不同药剂对黄瓜灰霉病的保护效果存在差异，当药剂浓度为200 mg/L时，仅有异菌脲的药效超过了50.00%，为52.18%，其余三者低于4700%；当药剂浓度为400 mg/L时，异菌脲和福美双的药效达到或超过了60.00%，分别为67.74%、60.00%， 而甲基硫菌灵和啶酰菌胺的药效低于50.00%，分别为46.05%、49.76%。

由表3可以看出，在离体条件下供试的4种化学农药中，异菌脲对黄瓜灰霉病的保护效果最好，EC50最小，为 170.95 mg/L，啶酰菌胺的保护效果最差，EC50最大，为 402.49 mg/L，后者是前者的2.35倍，即啶酰菌胺的保护效果仅为异菌脲的1/3至1/2；福美双和甲基硫菌灵的保护效果介于两者之间，EC50分别为219.83、367.68 mg/L。 表3 不同化学药剂对黄瓜灰霉病的离体保护作用

药剂毒力回归方程相关系数EC50（mg/L）95%置信区间异菌脲 y=2.408 7+1.160 5x0.998 1170.95131.22～222.71福美双 y=2.794 1+0.941 8x0.994 0219.83152.72～316.43 甲基硫菌灵y=2.396 4+1.014 9x0.950 5367.68231.16～584.82 啶酰菌胺 y=1.564 7+1.318 8x0.997 7402.49271.18～597.38

2.2.2 4种药剂对黄瓜灰霉病的离体治疗作用 接种3 d后离体条件下的治疗作用效果见表4、图4。在离体条件下异菌脲对黄瓜灰霉病的治疗效果最好，供试浓度下的抑菌率最高，当浓度为200 mg/L时，药效为60.97%，当浓度为400 mg/L时，药效达到71.69%，其抑菌的EC50最小，为106.88 mg/L；啶酰菌胺的治疗效果最差，当其浓度为400 mg/L时，药效不足50.00%，为47.58%，其抑菌的EC50最大，为456.62 mg/L。

2.3 4种药剂对黄瓜灰霉病菌菌丝生长的抑制作用

实验室内采用生长速率法测定4种化学药剂对黄瓜灰霉病菌菌丝生长的抑制作用，抑制率见图5，抑菌中浓度（EC50）见表5。在含药培养基上，4种化学药剂对黄瓜灰霉病菌菌丝生长的抑制效果较好，当药剂浓度为25.0 mg/L时，异菌脲对菌落生长的抑制率已达到59.25%；当药剂浓度为 50.0 mg/L 时，异菌脲和福美双对菌落生长的抑制率已超过80.00%，甲基硫菌灵对菌落生长的抑制率也达到69.27%；当药剂浓度为 100.0 mg/L 时，4种化学药剂对菌落生长的抑制率均超过75.00%，异菌脲、福美双和甲基硫菌灵的已达95.00%；当药剂浓度为200.00 mg/L时，4种化学药剂对菌落生长的抑制率均超过94.00%，异菌脲、福美双、甲基硫菌灵的抑制率已达100.00%。比较EC50，异菌脲、福美双、甲基硫菌灵和啶酰菌胺4种化学药剂对菌落生长的抑制中浓度分别为2057、26.23、31.12、45.93 mg/L，异菌脲的EC50仅为啶酰菌胺的 1/2，即异菌脲对黄瓜灰霉病菌菌丝生长的抑制效果是啶酰菌胺的2倍。

比较活体保护作用和菌丝生长抑制作用，异菌脲和啶酰菌胺活体保护作用的EC50分别为150.74、345.05 mg/L，两者对菌丝生长抑制作用的EC50分别为20.57、45.93 mg/L，保护作用EC50是菌丝生长抑制作用EC50的7.33、7.51倍，即药剂对菌丝生长的抑制效果是活体保护效果的7.33、7.51倍。

3 结论与讨论

农药田间药效试验是在田间进行的农药对有害生物施药效果的试验，这是确定新的农药品种能否在农业生产上大面积推广应用的重要方法。一般农药经室内试验证明有效后，方可进行田间药效试验，可见室内药效试验的重要性。

本研究在实验室内分别在活体和离体条件下，采用菌片接种法测定不同化学药剂对黄瓜灰霉病的保护作用和治疗作用。结果表明，供试的4种化学药剂对黄瓜灰霉病既有保护作用也有治疗作用，且随着药剂浓度的升高药效逐渐提高，与前人的研究结果[1-4]一致；化学药剂的保护作用优于治療作用，充分体现了“预防为主”的植保理念；化学药剂的活体效果优于离体效果，但离体条件下的药效趋势与活体条件下的药效趋势一致，说明可用离体试验代替活体试验。endprint

室内药效试验最常用的测定方法是菌丝生长速率法[5-6]。本研究在含药培养基上，采用菌丝生长速率法测定不同化学药剂对黄瓜灰霉病菌菌丝生长的抑制作用，与在寄主组织上的药效比较，化学药剂在培养基上的效果优于在寄主组织上的药效，如50%啶酰菌胺水分散粒剂在寄主组织上的EC50约为460 mg/L（活体上在345～362 mg/L之间，离体上在402～457 mg/L之间），在培养基上EC50约为 46 mg/L。出现这种差异的原因在于菌丝生长抑制作用试验是在实验室内培养条件恒定密闭的培养皿中进行的，药剂的活性成分无散发、培养基无抗性，药剂的药效全部发挥出来；而活体保护作用虽然也是在培养条件恒定的实验室内进行，但利用的是寄主苗，空间开放，药剂的活性成分有散发、寄主有抗性，药剂的药效不能百分百发挥出来。

唐明等通过田间药效试验发现，50%啶酰菌胺水分散粒剂对黄瓜灰霉病的防效较好，在用药量为5.625 kg/hm2时，防效在90%以上，用药量为3.375 kg/hm2时，防治效果在75% 以上，用药量在4.500 kg/hm2时，防治效果大于80%[7]。据此可推算出，啶酰菌胺田间药效的EC50约为 15 000 mg/L。这与本研究的室内结果差异明显，原因在于田间药效试验是在环境条件多变、空间完全开放的活体寄主上进行的，药剂的活性成分散失严重、寄主存在抗药性，药剂的药效发挥较弱。供试药剂在寄主组织上的药效远不如在培养基上对菌丝生长的抑制效果，但利用寄主组织进行药效试验与田间药效试验更近了一步，准确度更高，说服力更强。

农药本身，包括农药的化学成分、理化性质、作用机制、使用剂量以及加工性状等；防治对象，包括生物学特性和发育阶段等；环境因素，如温度、湿度、雨水、光照、风、土壤性质等，直接影响着病虫害的生理活动和农药性能的发挥，结果都会影响农药的药效[8]。因此，在使用农药前，必须掌握它的性能特点、防治对象的生物学特性，在施用过程中，充分利用一切有利因素，控制不利因素，以求达到最佳防治效果[9]。

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