多抗水稻分子标记辅助育种方法

任海+吕小红+杜萌

摘要：以抵御病虫害、提高水稻产量的绿色研究领域为背景，提出一种基于分子标记的多抗水稻辅助育种方法。采取分子标记辅助育种方法，能够完成拥有理想基因型或基因型组合的个体选择，并能够采取常规育种手段完成优良品种的培育。在此方法中，需要利用分子标记对目的基因进行跟踪，选择具有白叶枯病、稻瘟病、螟虫抗性基因的亲本，并从中选择优良恢复系和保持系，通过对目标基因相邻两侧的基因进行分子标记，结合杂交、回交、自交相结合的育种方法，并辅助于分子检测和分子标记的手段，在较短的培育周期内获得了多抗性征的优质稻种，最终通过遗传鉴定得到育种结果。同时，酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，简称ELISA）检测和6个感病指数检测的结果表明，培育出的新稻种对于稻瘟病、螟虫等病虫害具有明显的抗性，从而证实了基于分子标记的辅助育种方法可成功地培植出具有多抗性征的优质稻种。

关键词：水稻育种；分子标记；ELISA检测；稻瘟病

中图分类号： S511.03 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2017）19-0154-04

收稿日期：2016-12-31

基金项目：国家科技支撑计划（编号：2013BAD05B07）；耐盐高产优质水稻高效栽培技术示范推广（编号：GCNT-LN-16）；辽宁省博士科研启动基金（编号：20141169）；辽宁省水稻产业重大农技推广服务试点项目。

作者简介：任 海（1984—），男，辽宁盘锦人，助理研究员，主要从事水稻栽培及盐碱地改良研究。E-mail：61657137@qq.com。 在人类社会的各种粮食作物中，水稻占有极其重要的地位[1]。据统计，我国以水稻为主食的人口比例超过40%，世界以水稻为主食的人口比例接近50%[2]。可见，水稻的优质高产对于国计民生有至关重要的作用。

长期以来，水稻产量一直受到病害和虫害的困扰。其中，水稻病害中比较突出的有白叶枯病、稻瘟病，水稻虫害中比较突出的有螟虫、褐飞虱[3-6]。抵制病虫害的困扰、提高水稻产量，一直是水稻种植领域关心的重要问题。以农药为主的化学方法曾一度被广泛应用于水稻种植过程中，但最终被培育具有抗害基因稻种的绿色方法所取代。学者们不断挖掘抗病基因和抗虫基因，并结合植株表型进行杂交和回交以获得具有多抗基因的优质稻种[7]。但受到水稻培植周期的限制，这种方法获得优质稻种的时间过长[8]。但就目前来看，病虫害防治方面依然存在很多问题，因此在今后的科研工作中要进一步加大对病虫害研究的力度。本研究借助分子标记的方法，完成具有多抗基因的稻种培育，为缩短优质多抗稻种的育种周期提供借鉴。

1 研究原理、优势及现状

1.1 研究原理

分子标记辅助育种是结合目标基因型鉴定技术和传统育种技术的一种作物育种技术，该技术的运用，须要借助有性杂交使改良亲本中出现目的基因，能够使育种材料的筛选效率及育种目标的定向性得到提高[9]。在这一过程中，须要利用分子标记对目的基因进行跟踪，且该分子标记能够与目的基因紧密连锁或共分离，所以能够从目标区域和全基因组中筛选出育种分离群体中期望获得的个体，从而有效缩短育种进程。该方法的使用，须要完成前景选择和背景选择。前景选择即直接选择目标基因，目标基因与分子标记间的连锁程度将对方法的可靠性产生至关重要的影响。在选择的过程中，如果目标基因只有一个分子标记，就要确保二者紧密连锁，才能达到预期目标。因此，通过对目标基因相邻两侧的基因进行分子标记，能够使选择的正确率得到有效提高。背景选择除了进行目标基因的选择，还要选择基因组中其他性状。采取该选择方式，能够使遗传背景尽快恢复为轮回亲本基因组，从而使育种年限得到有效缩短。此外，采用该选择方法也能减少连锁累赘。目前，人类已经完成水稻高密度分子标记连锁图谱的创建，因此能够从选育群体中的各单株全基因组进行选择。表1为常用分子标记的优缺点比较，在实际采用分子标记法时还应结合试验条件及目的，选用适宜的标记类型。

1.2 研究优势

采取分子标记辅助育种方法，能够完成具有理想基因型或基因型组合的个体选择，并采取常规育种手段完成优良品种的培育。该方法能够在筛选材料时以多个基因为目标，并在一个育种材料中实现多个基因的聚合，因此能够有效改良品种品质。相较于普通筛选方法，可以完成目标性状的提前筛选。比如在育性恢复鉴定方面，如果能够提前1代，就可以在苗期完成后期性状的鉴定。此外，采用该育种方法也能使目标性状的鉴定得到延迟。例如，在鉴定多种病虫害的抗性时，植物很可能因为遭受某种病虫害胁迫而出现死亡或绝种现象。一旦出现这种情况，就难以进行多种病虫害抗性的同时鉴定，并使植株在其他性狀上的优异表现材料遭到丧失。但如果采用分子标记方法，就能完成多性状目标基因的鉴定，并在收种后实现分类验证。从总体上来看，采用分子标记辅助育种方法能够体现DNA水平上的选择差异，并对遗传变异进行反映，所以能够通过在不同时期的选择避免植株受周围环境影响，从而使水稻的育种效率和准确性得到有效提高。

1.3 研究现状

在抗性水稻品种培育方面，分子标记辅助育种方法已经取得了一定的应用进展。从原理上来看，该方法可以通过实现有利性状基因的转移和多个抗病基因的聚合来增强品种的抗性和抗谱差异，进而实现对抗性水稻品种的培育。基因聚合是在一个基因组中实现分散在不同品种中目标基因的聚合，能够用相对短的时间完成高产、多抗和优质杂交稻亲本或品种的培育[10]。通过在一个作物品种中聚合不同抗病虫基因，能够使该作物抗病虫能力的持久性得到增强，以避免在后续种植中进行杀虫剂和各种农药的喷洒。

白叶枯病为水稻的三大病害之一，感染该病的水稻产量会损失20%～30%，严重时甚至会出现颗粒无收的现象，因此其病害研究得到了诸多国家的重视。在抗白叶枯病水稻育种工作中，中国水稻研究所采取该方法完成了Xa21的转育，并完成了中恢218等具有强抗性和高产特点的水稻品种培育，其中Xa21是白叶枯病抗性基因，且具有广谱抗性[10]。随后，白叶枯病抗性基因Xa23也被李进波等利用分子标记选择方法转育出来[10]。经国际注册确认的水稻白叶枯病抗性基因接近40个，其中包含26个显性基因和38个隐性基因[11]。相较于其他基因，Xa23是在水稻育种中容易实现分子标记辅助选择的基因，因此具有一定的导入价值[12]。endprint

稻瘟病为真菌性病害，在世界范围内都属于危害最严重的水稻病害，具有危害大、分布广和发病率高等特点，并且一旦染病就难以进行控制，每年都会导致我国损失约10亿kg的稻谷。在水稻的整个生育期内，都有可能发生稻瘟病。实践研究证明，想要进行稻瘟病的防治，还要通过加强抗病品种的培育和种植来实现。而稻瘟病病菌群体中的毒性小种会因大面积单一品种的种植取得传播优势，容易造成病害流行，因此还要进行持久抗病品种的选育。在水稻抗稻瘟病育种方面，官华忠等则利用SRM22作为分子标记，完成了Pi-9抗病基因的转育[9]，陈学伟等采取分子标记方法完成了Pi-d（t）抗病基因的转育[13]。目前，人类已经得到了近70多个主效抗性基因，可用于水稻抗稻瘟病育种。

在水稻虫害方面，螟虫为危害性较大的虫害。目前，在浙江等地区，主要用于进行螟虫害防治的化学农药产品效果普遍较差。在这一背景下，转Bt基因或sck基因的抗螟虫水稻育种问题引起了人们的关注。在该方面，朱祯等使用潮霉素对双价cry1Ac（Bt）/sck抗虫转基因水稻进行了培育[14]。而李冬虎等通过研究发现，cry1Ac/sck能够较好地抵抗二化螟和三化螟等螟虫[12]。

从总体上来看，运用分子标记辅助育种方法进行的抗性水稻品种培育，在水稻品种质量性状选择方面取得了一定的成效。但是，含有单一抗病虫基因的水稻材料存在一定的局限性，即如果进行大面积推广和长时间种植就会出现抗性逐渐降低的问题。因此越来越多的学者开始对水稻多种病虫害抗性基因的聚合问题展开研究，以便通过将多抗性基因聚合到同一材料中而增强材料对病虫害的抗性。在杂交水稻品种研究方面，阳海宁等利用分子标记法分别完成了Xa23与Bph3的导入，从而获得了144份双抗性基因聚合系[15]。但从接种测试结果来看，与单一抗性基因的株系相比，具有双抗性基因聚合系的抗性水平并未得到明显提高[15]。而毛钟警等通过MAS技术，在同一材料中实现了抗褐飞虱基因与抗白叶枯病基因的聚合，并完成了个体的培育[16]。通过在3个新育成的水稻恢复系中进行Pi9和Xa23的导入，田大刚等完成了具有更高稻瘟病与白叶枯病抗性的恢复系培育，但得到的品种在材料和农艺性状方面与原有恢复系无明显差别[17]。在3种及以上多抗性基因聚合方面，分子标记方法也得到了应用。为对水稻品种的抗病虫高效性与持久性展开深入研究，一些育种专家开始采用分子标记辅助选择方法和回交转育法进行抗白叶枯病、抗稻瘟病等多个基因的聚合，并获得了杂交育种的中间材料。陈圣等采取该方法，将抗水稻螟虫、抗白叶枯病和抗稻瘟病的3种基因聚合到一起，并获得了纯合株系；该方法不仅能够使水稻抗谱得到扩宽，还能使抗性品种的使用年限得到延长[18]。目前，有关水稻病虫抗性基因的抗谱资源依然较少，须要进行持续不断的开发和挖掘。而在野生材料中，则蕴含较多抗性较好的资源，但这些材料多含有不利基因，一些基因或与目标抗性基因连锁，采用连续回交等方式容易丢失目标抗性基因。因此，目前还须要对现有发掘的抗性基因进行精确定位，以便完成更多水稻SSR标记的开发，进而有效提高分子标记辅助选择的准确性。

2 材料与方法

2.1 试验材料

在多抗水稻辅助育种的过程中，选择了以下3种主要的试验材料：CBB23水稻品种，携带有Xa23基因，该基因对于水稻白叶枯病具有显著抗性；Q1347水稻品种，携带有pi9基因，该基因对于稻瘟病具有显著抗性；科丰6号水稻品种，携带有cry1Ac/sck双组基因，该基因对于水稻螟虫具有显著抗性。

在水稻幼苗期摘取叶尖3～4 cm的新鲜叶片，置于 1.5 mL 离心管中，并于-20 ℃的条件下贮存，以供运用CTAB法进行少量DNA提取使用。

2.2 育种过程

为实现多抗水稻稻种的培育，本研究选择优良恢复系和保持系作为试验材料，结合杂交、回交、自交等育种方法，并辅助以分子检测和分子标记，最终通过遗传鉴定得到育种结果。详细的育种过程如下：（1）从试验材料中选择育种亲本，并分析亲本之间的多态性征；（2）确定亲本中的受体和供体，并执行受体和供体之间的杂交；（3）将（2）收获的杂交种和受体再次进行杂交，并结合田间性状和分子标记的结果进行进一步筛选；（4）将（3）筛选出的材料和受体再次进行杂交，并结合田间性状和分子标记的结果进行进一步筛选；（5）将（4）筛选出的材料和受体再次进行杂交，并以此杂交种和（4）的杂交种进行回交；（6）在（5）的杂交种中，结合田间性状和分子标记，选择优良单株进行2次自交，以获得育种结果。

目前，这种方法是常用的改良品种性状的方法，可以將目的性状基因的另一品系与供体进行多次回交，以便将供体亲本中的目的基因转移至受体亲本，以获得更优良的轮回亲本基因型。但是，在回交育种的过程中，有利基因导入的同时，与之连锁的不利基因也被导入。采用分子标记目的基因，在回交时则可以直接在目的基因附近进行个体重组，进而提升选择效率，避免“连锁累赘”的发生。水稻本身拥有较多的抗病基因，通过回交转育能够确保得到的抗性品种安全、有效。

育种的具体实施过程为：（1）选择具有聚合基因Xa23、pi9的优良稻系作为母本，将具有双组合基因cry1Ac/sck的优良稻系作为父本，于2014年3月在海南试验地进行杂交，获得S1。（2）将S1样本，于2014年6月在福建试验地进行种植，苗期辅助以分子标记。选择其中12株优良单株进行自交，于2014年9月收获S2。（3）于2014年11月将S2种植于海南试验地，苗期辅助以分子标记，筛选512株优良单株进行自交，于2015年4月收获S3。

2.3 分子标记方法

辅助分子标记，可以缩短育种周期，提高育种效率。因此，须要了解Xa23、pi9、cry1Ac/sck等3个基因的分子检测方法。

基因Xa23和表达序列标签（expressed sequence tag，简称EST）标记符合共显特征，两者的遗传距离为0.8 cm，预期条带800 bp。可采用浓度为2%的琼脂糖凝胶进行电泳检测，分子检测引物如下：Xa23F，5′-TAAGTTGTACTACGACCCCA-3′；Xa23R，5′-CACATGAAGAGCTGGAAACG-3′。endprint

基因pi9可检测自身，预期条带2 000 bp。可采用浓度为1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测，分子检测引物如下：pi9F，5′-ATGGTCCTTTATCTTTATTG-3′；pi9R，5′-TTGCTCCATC TCCTCTGTT-3′。

基因cry1Ac/sck可检测自身，预期条带分别为800、400 bp。可采用浓度为1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测，分子检测引物如下：crylAcF，5′-TGCAGAGAGCTTCAGAGAGTG-3′；crylAcR，5′-ACACCCTGACCTAGTTGAGC-3′；sckF，5′-AAAATGAAGAGCACCATCTTC-3′；sckR，5′-TCTAGAGTT CATCTTTCTCATC-3′。

2.4 抗性检测方法

为了证实本研究培育的S3纯合株系所具有的多抗性特征，需进行进一步抗性检测。

首先，采用ELISA检测方法检测S3纯合株系中cry1Ac的表达量。株系的cry1Ac表达量反映了稻种对螟虫的抑制效果，主要通过检测苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis，简称Bt）含量来确定cry1Ac的表达量。在检测的过程中，使用双抗体夹心法进行水稻Bt含量的检测，即对其中一个夹板进行90 min的紫外线照射处理，然后分别用处理和未处理夹板进行Bt梯度的测定。在测定过程中，须要使用碳酸盐缓冲溶液（carbonate buffer solution，简称CBS）进行IgG溶液的稀释，直至溶液浓度达到1 μg/mL。夹板上共100个孔，每孔加 100 μL，并在4 ℃条件下包被过夜。在封闭孔时，需要每孔添加浓度为2%的牛血清白蛋白135 μL，并在37 ℃条件下封闭1 h。

其次，采用6个感病指数来检验S3纯合株系的稻瘟病及其他常见稻病的抗病性征。在测试前，需要将在滤纸片上保存的菌株转移至酵母淀粉培养基上，在28 ℃的暗箱中培养 4～5 d后，将其转移至米糠培养基上培养7～8 d，然后将培养皿上的菌丝刮去，并在25～28 ℃的光照培养箱中进行培养。约3 d后，利用蒸馏水将孢子清洗下来，然后利用擦镜纸进行过滤，并完成孢子悬液的培养，以供接种使用。在育苗时，将长至3叶1心的水稻幼苗移至发病室内，利用空压机连接头进行喷雾接种。每盘苗须要喷洒50 mL孢子悬液，并在保湿筒内持续保湿24 h，然后移到筒外，进行定时喷雾。在接种后6～7 d，植株病情已经基本稳定，可以进行发病情况的调查。在秧龄达到25 d后，进行秧苗移栽，并且在之后1个月内不使用任何杀虫剂。在进行虫害鉴定时，在定圃四周种植8行感虫品种作为对照，从而实现对纵卷叶螟虫的诱集和增加。以自然誘集稻纵卷叶螟产卵为虫源进行鉴定，并利用细目纱网对需要鉴定的水稻进行笼罩。完成鉴定后，喷施5%氟虫腈悬浮剂，以免虫源向外围扩散。在接种时，仍然采用表1中的3个样本。

3 结果与分析

3.1 分子标记

多抗稻种培育成功后，对各纯合株系进行分子检测，其中一个样本的分子检测结果如图1所示。从图1可以看出，该样本同时具备了抑制白叶枯病的基因Xa23、抑制稻瘟病的基因pi9、抑制螟虫的双组合基因cry1Ac/sck。从分子检测的角度证明了多抗稻种的成功培育。

3.2 抗性检测

从表3可以看出，S3的3个样本的Bt相对含量分别达到了0.121 1%、0.122 7%、0.121 2%，均超过了0.100 0%，说明3个样本对螟虫存在明显抗性。

从表4可以看出，S3等3个样本的6个感病指数均低于

5%，充分说明3个样本对稻瘟病及其他稻病具有明显抗性。而在螟虫防治方面，S3的3个样本表现出了良好的纵卷叶螟抗性，很少有卷叶出现，并且卷叶程度较低，多数叶肉并未受到损伤，而对照组的卷叶率则达到了90%以上，并且叶肉受到了严重蚕食。

综合以上2组抗性检测结果，证实了基于分子标记的辅助育种方法成功地培育出了具有多抗性征的优质稻种，可以防治主要病虫害对稻种的危害。

根据水稻育种领域的已有文献可知，基因Xa23对于白叶枯病的抑制效果非常优异，基因pi9对于稻瘟病的抑制效果非常优异，双组合基因cry1Ac/sck对于螟虫的抑制效果非常优异。本研究在分子检测标记的技术手段辅助下，将这3种优秀基因进行聚合，培育出具有多抗属性的水稻优良恢复系。利用与抗白叶枯病与抗稻瘟病基因连锁的分子标记与抗螟虫基因的直接相关引物对基因供体亲本展开多态性分析可以发现，采取的分子标记为共显性标记，EST标记在供体亲本中扩增出800 bp的特征条带，基因pi9在供体亲本中扩增出2 000 bp特征条带，基因cry1Ac、sck在供体亲本中分别扩增出800、400 bp特征条带。在亲本之间，各连锁标记具有多态性，能够在分子标记辅助选择中得到应用。利用标记与检测的基因进行分离世代选择，最终完成3种基因纯合株系的聚合。

4 讨论

水稻是中国乃至世界范围内最重要的粮食作物，其产量关乎人类的生存和发展。如何有效抑制病害和虫害、提高水稻产量，是水稻种植领域需要持续关注的焦点问题。据不完全统计，世界上危害水稻的侵染性病害达300多种，其中有些病害分布在全世界范围内，有些则存在于部分地区。在我国白叶枯病、稻瘟病、螟虫都是重要的水稻病虫害，因此选育能够抵抗这3种水稻病虫害的多抗水稻可带来明显的经济效益和社会效益。在过去一段时间内，多利用抗病亲本的主效抗病基因进行水稻育种。受病原菌致病小种变化因素的影响，在进行单一抗病品种大面积种植时容易出现水稻大面积感病问题，继而导致水稻生产承受更多损失。因此，须要进行多个抗病基因的聚合，从而实现多抗水稻品种的培育，更好地预防水稻生产病害。此外，抗病害基因育种的绿色方法，是取代以农药为主的化学方法的必然选择，也是今后水稻育种领域的主要发展趋势。但在过去较长的时间里，基因聚合法一直因为无法实现抗性基因的有效检测而无法得到实践应用，以致于持久抗性水稻品种的培育问题无法得到有效解决。分子标记辅助选择育种方法，能够利用建立在DNA多态性上的分子标记技术实现对抗性基因的标记，从而有效进行聚合体抗性基因的检测。endprint

本研究表明，含有单一基因Xa23、pi9、cry1Ac/sck的单株，可以通过杂交、回交、自交等手段，获得具有多抗性征的优良稻种。由此可见，采用基因聚合方法能够完成多抗水稻品种的有效培育。分子检测、分子标记等手段的使用，可以缩短育种周期、简化培育过程，是多抗水稻品种培育的有效方法。本研究结果为多抗优质水稻品种的培育提供了一种可以借鉴的思路和方法。另外，除了常規育种工作，还应在工作实用化和杂种优势评价方面展开深入研究，因此，在后续研究中，进一步将得到的3抗材料与优良恢复系亲本进行配组，并评价综合指标，以便使得到的水稻改良品种能够被广泛应用。此外，还应对改良得到的同一恢复系的遗传背景、配合力及农艺性状等方面的差异展开评价。

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