新型冠状病毒预防Ⅱ号方质量标准研究

郭 舟，王 康，张 勤△，闫俊锋，唐 松

（1.湖北省襄阳市公共检验检测中心，湖北 襄阳441004；2.湖北省药品监督管理局襄阳分局，湖北 襄阳441022）

新型冠状病毒（简称新冠病毒）预防Ⅱ号方为由湖北省襄阳市疫情防控指挥部批准同意，指定医院配制并调剂使用的中药制剂，用于预防新型冠状病毒肺炎(简称新冠肺炎)，效果良好，具有益气固表、祛浊排毒功效。方中，黄芪性甘微温，内可补益肺脾，外可固表止汗，为君药［1］；炒白术、连翘、金银花补气健脾、清热解毒、消炎排毒，有助于加强黄芪益气固表功效，为臣药；其他药味具有佐药或使药功效。但该方剂为特殊时期临时调剂使用，无国家的制剂批准文号，其质量无法进行评价。黄芪在各类新冠肺炎预防方剂中出现的频次最高，故测定黄芪的含量十分必要［2-5］，而黄芪甲苷是黄芪的活性成分，具有调节免疫、抗炎和抗病毒等作用［6-8］。连翘苷是连翘中含量较高的主要活性成分，具有极强的抗菌、抗病毒和抗炎作用［9-10］。本研究中采用薄层色谱法对主要药味黄芪、连翘进行定性鉴别，采用高效液相色谱（HPLC）法对其主要活性成分黄芪甲苷、连翘苷进行含量测定。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters e2695型高效液相色谱仪［配有2424型蒸发光散射检测器（ELSD)，美国Waters公司］；岛津LC-20AT型高效液相色谱仪［配有二极管阵列检测器（DAD），日本岛津公司］；XS205型电子天平（精度为0.01 mg），AL204型电子天平（精度为0.1 mg），均购自瑞士梅特勒-托利多公司；HU-6150B型超声波清洗器（天津恒高电气科技有限公司，功率为250 W，频率为40 kHz）；G201990806型硅胶G板（青岛海洋化工有限公司）；ZF-I型三用紫外分析仪（上海顾村电光仪器厂）；202-1AB型电热恒温干燥箱（天津市泰斯特仪器有限公司）；HH-4型数显恒温水浴锅（国华电器有限公司）。

1.2 试药

乙腈（色谱纯，Sigma-Aldrich公司），超纯水，其余试剂均为分析纯；黄芪甲苷对照品（批号为110781-201717，含 量 为96.9%），连 翘 苷 对 照 品（批 号 为110821-201816，含量为95.1%），均购自中国食品药品检定研究院；新冠病毒预防Ⅱ号方（由指定的医院制作，批号分别为20200229，20200324，20200527，规格为每瓶200 mL）；黄芪阴性样品（按处方比例取除黄芪外的药材，按指定医院工艺制备）；连翘阴性样品（按处方比例取除连翘外的药材，按指定医院工艺制备）。黄芪(批号为200101)，炒白术(批号为200101)，均购自湖北同仁恒康中药饮片公司；防风(批号为20191201)，连翘(批号为20200101)，金银花(批号为20200102)，佩兰(批号为20200202)，焦山楂(批号为20190901)，均购自武汉市汉口国药公司；陈皮(批号为20200101，襄阳华源天盛药业公司)；紫苏(批号为20200021，国药控股襄阳公司)。

2 方法与结果

2.1 薄层色谱鉴别

黄芪：取3批样品，各30 mL，用30 mL水饱和的正丁醇萃取3次，合并正丁醇液，用40 mL氨试液洗涤3次，弃去水液，正丁醇液蒸干，加1 mL甲醇溶解残渣，作为供试品溶液。取黄芪阴性样品，按供试品溶液制备方法制备黄芪阴性对照品溶液。另取黄芪甲苷对照品适量，精密称定，用甲醇制成质量浓度为0.5 mg/mL的对照品溶液。吸取供试品溶液、黄芪阴性对照品溶液、对照品溶液各5μL，点于同一硅胶G板上，以氯仿-甲醇-水（13∶7∶2，V/V/V）下层液为展开剂，预饱和30 min，展开，晾干，喷以10%硫酸乙醇液，105℃烘箱加热至斑点显色清晰。结果供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应位置上显相同颜色的棕褐色斑点，黄芪阴性对照品溶液色谱无此斑点；置紫外灯（365 nm）下检视，供试品溶液和对照品溶液显相同颜色的橙黄色荧光斑点，而黄芪阴性对照品溶液色谱无此斑点。详见图1。

图1 黄芪薄层色谱图1-3.test solution 4.reference solution 5.negative reference solution A.Sunlight B.Ultraviolet lampFig.1 TLC chromatograms of Astragail Radix

连翘：取3批样品，各30 mL，用30 mL水饱和的正丁醇萃取3次，合并正丁醇液，用40 mL氨试液洗涤3次，弃去水液，再用正丁醇饱和的水洗至近中性，正丁醇液蒸干，残渣加1 mL甲醇溶解，作为供试品溶液。取连翘阴性样品，按供试品溶液制备方法制得连翘阴性对照品溶液。另取连翘苷对照品适量，精密称定，用甲醇制成质量浓度为60μg/mL的对照品溶液。吸取供试品溶液、连翘阴性对照品溶液、对照品溶液各5μL，点于同一硅胶G板上，以氯仿-甲醇（5∶1，V/V）为展开剂，预饱和30 min，展开，晾干，喷以10%硫酸乙醇液，105℃烘箱加热至斑点显色清晰。结果供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应位置上显相同颜色的斑点，而连翘阴性对照品溶液色谱无此斑点；置紫外灯（365 nm）下检视，供试品溶液与对照品溶液显相同颜色的荧光斑点，而连翘阴性对照品溶液色谱无此斑点。详见图2。

图2连翘薄层色谱图1-3.test solution 4.reference solution 5.negative reference solution A.Sunlight B.Ultraviolet lampFig.2 TLC chromatograms of Forsythiae Fructus

2.2 黄芪甲苷含量测定

2.2.1 色谱条件

图3 黄芪甲苷含量测定高效液相色谱图1.astragalosideⅣA.Test solution B.Reference solution C.Negative reference solution Fig.3 HPLC chromatograms for content determination of astragalosideⅣ

色谱柱：AgilentEclipseXDB-C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流动相：乙腈-水（32∶68，V/V）；流速：1.0 mL/min；柱温：35℃；进样量：5～20μL。ELSD参数：喷雾器为冷却模式，漂移管温度为60℃，气体压力为30 Psi。

2.2.2 溶液制备

取黄芪甲苷10.78 mg，精密称定，置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解，定容，摇匀，即得质量浓度为0.208 9 mg/mL的对照品溶液。精密量取供试品25 mL，用水饱和的正丁醇萃取3次，每次30 mL，合并正丁醇液，再用氨试液洗涤3次，每次40 mL，弃去水层，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇溶解，定容至5 mL，摇匀，取上清液，即得供试品溶液。按供试品溶液制备方法制备黄芪阴性对照品溶液。

2.2.3 方法学考察

专属性试验：取2.2.2项下3种溶液，依法测定。结果对照品溶液和供试品溶液在16～17 min处有相同色谱峰，黄芪阴性对照品溶液则无此色谱峰。详见图3。

线性关系考察：精密吸取对照品溶液（质量浓度为10.208 9 mg/mL）5，10，20，30，40μL，依法测定，以峰面积的对数（lgA）为纵坐标、黄芪甲苷进样量的对数为横坐标（lgC，μg）绘制标准曲线，得回归方程lgA=1.561 38 lgC+4.647 017，r=0.999 6（n=5）。结果表明，黄芪甲苷进样量在1.044 5～8.356 7μg范围内对数值与其峰面积对数值线性关系良好。

检测限与定量限考察：以信噪比(S/N)=3∶1为标准测得黄芪甲苷的最低检测限为0.2434μg，以S/N=10∶1为标准测得黄芪甲苷的定量限为0.811 3μg。

精密度试验：精密吸取对照品溶液（质量浓度为0.208 9 mg/mL）20μL，连续进样6次，依法测定。结果黄芪甲苷峰面积的RSD为0.68%（n=6），表明仪器精密度良好。

重复性试验：取同一批(批号为20200324)样品，按2.2.2项下方法制备供试品溶液6份，按2.2.1项下色谱条件进样测定。结果样品中黄芪甲苷的平均含量为0.037 2 mg/mL，RSD为1.01%（n=6），表明方法重复性良好。

稳定性试验：取同一批（批号为20200324）样品，分别于0，3，6，9，12，24 h时进样测定。结果黄芪甲苷峰面积含量的RSD为1.33%（n=6），表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

加样回收试验：精密量取同一批（批号为20200324，含量为0.037 2 mg/mL）样品6份，各20 mL，分别精密加入对照品溶液1.00，1.00，2.00，2.00，3.00，3.00 mL，按2.2.2项下方法制备供试品溶液6份，依法测定含量，并计算回收率。结果见表1。

表1 黄芪甲苷加样回收试验结果（n=6）Tab.1 Recovery test of astragalosideⅣ（n=6）

2.2.4 样品含量测定

精密量取3批（批号分别为20200229，20200324，20200527）样品各25 mL，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，对照品溶液分别进样5μL和20μL，供试品溶液进样10μL，依法测定峰面积，按外标两点法对数方程计算含量。结果样品中黄芪甲苷的含量分别为0.032，0.037，0.040 mg/mL。

2.3 连翘苷含量测定

2.3.1 色谱条件

色谱柱：AgilentEclipseXDB-C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流动相：乙腈-水（20∶80，V/V）；流速：1.0mL/min；柱温：30℃；检测波长：277nm；进样量：10μL。

2.3.2 溶液制备

图4 连翘苷含量测定高效液相色谱图1.phillyrinA.Test solution B.Reference solution C.Negative reference solutionFig.3 HPLC chromatograms for content determination of phillyrin

取连翘苷15.85 mg，精密称定，置25 mL容量瓶中，加甲醇溶解，定容，摇匀，作为对照品贮备液。精密量取对照品贮备液5 mL，置50 mL容量瓶中，加甲醇定容，摇匀，即得连翘苷质量浓度为60.29μg/mL的对照品溶液。精密量取本品10 mL，加甲醇适量，超声处理（功率为250 W，频率为40 kHz）30 min，冷却后定容至25 mL，摇匀，滤过，即得供试品溶液。按供试品溶液制备方法制备连翘阴性对照品溶液。

2.3.3 方法学考察

专属性试验：取2.3.2项下3种溶液，依法测定。结果连翘苷对照品和供试品溶液在30～31 min处有相同色谱峰，连翘阴性对照品溶液无此色谱峰。详见图4。

线性关系考察：精密量取对照品溶液（质量浓度为60.29μg/mL），加甲醇制成系列质量浓度为6.029 3，12.058 7，30.146 7，60.293 4，90.440 1，120.586 8μg/mL的溶液，依法测定峰面积。以连翘苷质量浓度（X，μg/mL）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得 回 归 方 程Y=6 535.279 27X-3 455.049 39，r=0.999 9（n=6）。结果表明，连翘苷质量浓度在6.029 3～120.586 8μg/mL范围内与峰面积线性关系良好。

检测限、定量限考察：以S/N=3∶1为标准测得连翘苷的最低检测限为0.016 4μg，以S/N=10∶1为标准测得黄芪甲苷的定量限为0.054 5μg。

精密度试验：取对照品溶液，连续进样6次，依法测定。结果连翘苷峰面积的RSD为0.62%（n=6），表明仪器精密度良好。

重复性试验：取同一批（批号为20200527）样品，按2.3.2项下方法制备供试品溶液6份，依法测定。结果连翘苷的平均含量为0.174 1 mg/mL，RSD为0.92%（n=6），表明方法重复性良好。

稳定性试验：取同一批（批号为20200527）样品，依法制备供试品溶液，分别于0，3，6，9，12，24 h时进样测定。结果连翘苷峰面积含量的RSD为1.02%（n=6），表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

加样回收试验：精密量取同一批（批号为20200527，含量为0.174 1 mg/mL）样品6份，各5 mL，分别精密加入对照品溶液5 mL，按2.3.2项下方法制备供试品溶液6份，依法测定含量，并计算回收率。结果见表2。

表2 连翘苷加样回收试验结果（n=6）Tab.2 Recovery test of phillyrin（n=6）

2.3.4 样品含量测定

精密量取3批（批号分别为20200229，20200324，20200527）样品，各10 mL，按2.3.2项下方法制备供试品溶液，对照品溶液和供试品溶液各进样10μL，依法测定峰面积，按外标法计算含量。结果样品中连翘苷的含量分别为0.178，0.188，0.174 mg/mL。

3 讨论

3.1 薄层色谱鉴别

黄芪的薄层鉴别通过增加氨试液洗涤，以减少酸性组分干扰，结果黄芪甲苷斑点显示清晰、分离效果较好。连翘苷属木脂素类大极性化合物，水溶性好，其薄层鉴别采用水饱和的正丁醇提取，有效提取了有效成分；比较了以氯仿-甲醇-水（13∶7∶2，V/V/V）下层液、氯仿-甲醇（8∶1，V/V）和氯仿-甲醇（5∶1，V/V）作为展开剂的薄层色谱情况，结果采用氯仿-甲醇（5∶1，V/V）为展开剂，展程达到15 cm时，连翘苷可完全分离，比移值适中，且斑点显色清晰。

3.2 色谱条件优化

紫外光谱测定发现，黄芪甲苷溶液与空白溶剂在190～400 nm波长范围内无明显紫外吸收差异，故HPLC-DAD法不适合测定其含量。参考文献［11-13］，采用HPLC-ELSD法测定黄芪甲苷的含量，当流动相为乙腈-水（32∶68，V/V）时，黄芪甲苷色谱峰可完全分离，且重复性好，阴性对照无干扰。

采用HPLC-DAD法测定连翘苷的含量，考虑了不同洗脱条件，即乙腈（A）-0.2%甲酸（B），梯度洗脱（0～60 min时15%A→45%A，85%B→55%B），乙腈（A）-0.05%磷酸（B）梯度洗脱（0～60 min时15%A→40%A，85%B→60%B）的洗脱效果，结果连翘苷出峰时间慢（约50 min），系统稳定性较差，不利于快速检测样品；后又调整流动相为乙腈-水（25∶75，V/V），结果连翘苷出峰时间快（约20 min），但与其他峰分离不完全，色谱峰纯度未到90%；最后优化流动相比例为乙腈-水（20∶80，V/V），结果连翘苷出峰时间约为30 min，与其他峰完全分离，系统适用性好，结果准确可靠，方法重复性良好。

3.3 方法评价

本研究中建立的方法操作简便、准确可靠、重复性好，可用于新冠病毒预防Ⅱ号方的质量评价。