包虫病致病机制及新药研发基础研究CYP1A2基因单核苷酸多态性与囊型包虫病关联性分析①

亚库甫·托合提，刘 辉，李 亮，杨 宁，林仁勇，吕国栋

（新疆医科大学第一附属医院临床医学研究院,乌鲁木齐830054）

包虫病是棘球绦虫的幼虫寄生于宿主体内引起的人兽共患寄生虫病[1]。我国有2种包虫病,即细粒棘球蚴引起的囊型包虫病和由多房棘球蚴引起的泡型包虫病，在临床囊性包虫病最为常见[2]。我国是全球包虫病患者最多的国家之一，新疆维吾尔自治区是我国囊性包虫病流行的重点区域[3]。西部地区受包虫病威胁，每年经济损失严重[4]。目前如何对包虫病进行有效防治是一个公共卫生问题。疾病的严重程度、临床转归及疾病感染率由多个因素决定，这其中基因变异有着重要的作用[5]。单核苷酸多态性(SNP)是基因组中重要的遗传变异之一，研究人员发现HLA等基因的SNP与包虫病感染风险存在关联性[6]。然而其他基因的SNP在包虫病易感性和致病机制中的作用尚待研究。CYP1A2是编码细胞色素P450超家族酶的一个基因，位于15号染色体上[7]，主要在肝细胞中表达,在许多致癌物和内源性化合物的激活和排毒过程中发挥重要作用[8]。它在维持身体健康扮演着一个重要的角色[9]。已有研究发现CYP1A2基因遗传变异与直肠癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌等多种重大疾病发生密切相关，CYP1A2*C(rs2069514)和CYP1A2*F(rs762551)多态性是两个最常被研究基因位点[10]。而目前CYP1A2基因SNP与包虫病发病风险的关联性研究仍未见报道。基于此，本研究探讨CYP1A2基因SNP与包虫病患者发病风险和临床分型的相关性，为早期识别社区风险群体提供依据，并评估其作为包虫病患者早期诊断新型分子标志物的可行性。

1 对象与方法

1.1 对象 选取2012年6月－2018年6月在新疆医科大学第一附属医院诊断为囊型包虫病的患者162例为病例组。选取同期来本院体检的健康体检者156例为对照组。两组受检者性别构成、年龄相匹配、民族构成差异无统计学意义。所有患者均符合《肝两型包虫病诊断治疗专家共识》(2015年版)[4]。纳入标准为：(1)性别不限，民族不限。(2)患有肝包虫病和肝脏在CT图像中能完整并正常呈现的患者。(3)曾与狗等家畜有接触史或者在日常接触人群中具有肝包虫患者。排除标准为：(1)其他合并感染性疾病，代谢性疾病患者。(2)肝脏先天性不完整或功能缺陷者。本研究经过本院伦理委员会审查通过，所有受检者均同意参加本研究并签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 EDTA抗凝管无菌采集5 mL静脉血，存于-80℃冰箱；北京天根公司全血DNA试剂盒提取DNA，采用Nanodrop 2000分光光度计测量DNA纯度和浓度。

1.2.2 基因型检测 采用TaqMan探针基因分型技术对:rs2069514和rs762551多态性进行检测。TaqMan SNP Genotyping Assays试剂盒和TaqMan SNP Genotyping Mix试剂盒购自美国ABI公司。应用7900 HT荧光实时定量PCR仪(ABI，美国)进行PCR反应，CYP1A2基因位点rs2069514-引物序列：F：5'-TTGCAAAAATTCATCAAGCTACA-3'，R：5'-GAG TGAGGCCAGGAGTTCAA-3'。rs762551-引物(F:5'-CTGATGCGTGTTCTGTGCTT-3',R:5'-AGAGAGCCAGCGTTCATGTT-3')。PCR反应体系为5μL，包括2×Taq-Man Master Mix试剂2.0μL,40 x TaqMan Genotyping Assay试 剂0.05μL、DNA(15～20 ng/μL)2μL、H2O 0.95μL,共50个循环。PCR反应参数:95℃10 min,95℃15 s,60℃1 min。每例样本重复检测3次。应用Sequence Detector Software version 2.1(SDS version 2.1)图像分析软件进行基因型分析。若只有FAM或VIC荧光增强的样本，其SNP分型为纯合子，若FAM和VIC同时增强则为杂合子。

1.3 统计学分析 采用SPSS23.0软件进行数据统计分析。服从正态分布的计量资料描述用均数±标准（±s）表示，两组间差异性分析采用t检验，不满足正态分布的资料采用非参数检验(Kruskal-Wallis)。计数资料采用n表示，组间比较采用卡方检验；采用卡方检验分析受检者SNP基因型分布是否符合Hardy-Weinberg平衡。应用非条件Logistic回归模型分析SNP基因型与包虫病发病风险的关联，并通过年龄、性别、民族等因素进行校正，计算OR值和95%置信区间(CI)。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 研究对象的一般特征 病例组162例，男性82例、女性80例，年龄（38.4士14.0）岁，对照组156例，男性88例、女性68例，年龄（40.1士12.4）岁。病例组年龄＜30岁的47例、30～60岁的104例、＞60岁的11例,对照组年龄＜30岁的30例、30～60岁的115例、＞60岁的11例。病例组中有包虫活力的134人，无包虫活力的28人。

2.2 CYP1A2基因SNP不同基因型在人群中的分布 每个SNP位点3种基因型在两组受检者中的分布发现，SNP位点rs2069514 GG、GA、AA基因型在两组分布差异有统计学意义(P＜0.05)，rs762551位点3种基因型分布在两组分布差异无统计学意义(P＞0.05)。见表1。

表1 CYP1A2基因SNP在病例组和对照组的分布/例（%）

2.3 CYP1A2基因SNP位点rs2069514基因型与囊型包虫病发病风险的关联性 突变型基因（GA＋AA）的人群与野生型基因(GG)人群相比，囊型包虫病的发病风险提高了109%[OR（95%CI）=2.09(1.25～3.51),P=0.005]，纯突变型基因（AA）的人群与包含突变型基因(GA＋GG)人群相比，囊型包虫病的发病风险降低了48%[OR（95%CI）=0.42(0.21～0.82),P=0.005]，见表2。

2.4 CYP1A2基因SNP基因型与包虫病临床分型的关联性 CYP1A2基因SNP位点rs2069514和rs762551均与包虫病临床分型无关联，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

表2 CYP1A2基因SNP位点rs2069514基因型与囊型包虫病发病风险的关联性

表3 CYP1A2基因SNP基因型与包虫病临床分型的关联性/例（%）

3 讨论

包虫病是由棘球绦虫幼虫感染引起的[11]。感染性疾病的发生和发展是一个复杂的过程，是致病微生物、宿主与环境相互作用的结果[12]。暴露于相同的危险因素下,同一地区的同一人种包虫病发病率不同,提示宿主的遗传多态性与包虫病的易感性相关[13]。多项研究报道感染性疾病的易感性与单核苷酸多态性相关[14]，关于包虫病感染易感性与单核苷酸多态性相关的研究报道较少。CYP1A2基因SNP与多种疾病易感性密切相关，然而它与包虫病感染的关联性仍未见报道。本研究首次发现CYP1A2基因SNP与包虫病感染风险存在显著关联。

人类CYP1A2基因是高度多态的，其中中国人突变最多的SNP位点是rs2069514、rs762551[15]。rs2069514又称为-3860 G＞A，位于CYP1A2基因编码区上游区域，该SNP突变导致日本吸烟者CYP1A2活性显著降低[16]。国外研究报道CYP1A2基因SNP位点rs2069514与肺癌风险增加相关，它和膀胱癌风险降低相关[17]。本研究中CYP1A2基因SNP位点rs2069514在病例组和对照组中GG、GA、AA基因型分布有差异，提示CYP1A2基因SNP位点rs2069514与包虫病易感性相关，包含突变型GA＋AA的人群与野生型GG人群相比，囊型包虫病的发病风险提高，纯突变型AA与GA＋GG相比发病风险降低，提示rs2069514 GA基因型可能是包虫病感染的危险因素，其影响包虫病发生的功能机制有待进一步研究。

有研究报道CYP1A2基因SNP位点rs762551与白种人得肺癌风险增加有关[18]，另有研究报道SNP位点rs762551与结直肠癌风险降低相关[19]。而本研究显示，SNP位点rs762551与包虫病易感性无相关性。本研究中CYP1A2基因SNP位点rs2069514和rs762551均与包虫病临床分型无关联性，可能原因是样本数量较少，需进一步扩大样本量以获得更为客观正确的结果。

CYP1A2是重要的药物代谢酶[20]。CYP1A2参与众多的内源性和外源性化合物，包括致癌物的代谢转化，以及它在各种疾病发展中发挥重要作用[7]。CYP1A2表达存在较大的个体差异[10]，这跟药物代谢有关[21]。现有治疗包虫病的阿苯达唑等药物的利用效率低[3]，CYP1A2参与阿苯达唑的代谢过程[22]，提示,开展阿苯达唑药物代谢额浓度与CYP1A2基因SNP的关联性研究很有必要，对临床指导阿苯达唑治疗包虫病具有一定的意义。

目前包虫病易感性的研究主要集中在免疫方面[23]。本研究发现了CYP1A2 SNP与包虫病感染风险的关联性，增加了SNP与包虫病易感性的一个研究思路。人类基因组序列已揭示约107个人类CYP基因：59个活跃基因和约48个假基因，在编码异源生物代谢酶的基因（CYP1-3）中，除了相对保守的CYP1A1和CYP2E1外，其他基因也具有大量的SNP位点。本研究仅探索了CYP1A2基因rs2069514和rs762551与囊性包虫病的相关性，其他SNP位点也具有一定研究价值,尚待今后进一步研究。

综上所述，CYP1A2基因SNP位点rs2069514与包虫病易感性相关。在DNA水平研究包虫病易感性,有助于了解包虫病的发病机制，为包虫病未来的基因诊断以及预防奠定坚实的基础。