泡球蚴感染小鼠肝脏差异表达miRNA筛选及其作用通路分析①

刘 辉，叶建蔚，张凯楠，吕国栋

(新疆医科大学第一附属医院1临床医学研究院，2肿瘤中心，乌鲁木齐830054)

包虫病是棘球绦虫的幼虫感染并寄生所致的疾病，多房棘球蚴（泡球蚴）感染人体所致的泡型包虫病（Alveolar echinococcosis，AE)是我国西部牧区高发的一种人畜共患病[1]。肝脏是泡球蚴寄生的主要器官之一，泡球蚴以出芽生殖的方式浸润病灶旁肝脏，和肝癌的临床特征较为相似，如未经治疗，10年病死率高达90%，故又称“虫癌”[2]。在泡球蚴感染中间宿主的过程中，寄生虫和宿主之间的相互作用极其复杂，其致病机制有待进一步阐明[3]。

微小RNA（miRNA）是一类重要的非编码RNA，在免疫调控、机体发育、代谢合成等基础生理功能的调控过程中发挥重要作用，miRNA通过抑制靶基因翻译或靶基因mRNA降解等方式，诱导基因沉默[4]。在肿瘤、代谢性和感染性等疾病的致病过程中miRNA是关键参与者[5]，如miR-34a等是致癌基因[6]，而let-7是抑癌基因[7]。miRNA作为疾病的诊断标志物和干预靶标成为研究的热点。在包虫病研究中，Orsten等[8]发现hsa-miR-4659a-5p和hsa-miR-4518等miRNA在囊型包虫病患者血清中低表达。Boubaker等[9]发现MMU-miR-148a-3p和MMU-miR-101b-3p等miRNA在小鼠感染泡球蚴早期的肝脏中的基因表达受到调控。泡球蚴感染中期是一个非常重要的阶段[10]，这个阶段发挥调控作用的miRNA极具研究价值。因此本研究用基因芯片技术筛选了泡球蚴感染中期差异表达的miRNA，并预测了这些miRNA可能影响的生物学功能和信号通路，为进一步鉴定在泡型包虫病致病性中起作用的miRNA奠定了基础。

1材料和方法

1.1 实验动物 选取54只SPF级雌性健康Balb/c小鼠，8～10周龄，体重18～20 g，购于新疆医科大学实验动物中心。饲养条件为室温20～25℃，相对湿度40%，自由饮水饮食。

1.2 材料 Trizol试剂购于美国Invitrogen公司，哺乳动物用miRNAs微阵列芯片及对应试剂盒购于北京博奥生物有限公司，固体石蜡购于天津市福晨化学试剂厂，甲醛溶液等购于天津市富宇精细化工有限公司，苏木素和伊红染料购于北京中杉金桥试剂公司。

1.3 方法

1.3.1 泡球蚴获取 无菌操作下从泡球蚴保种鼠腹腔中取出泡球蚴的囊泡组织，经匀浆后，生理盐水反复冲洗，过滤除去囊泡碎片，收集泡球蚴原头蚴。采用伊红染色法检测原头蚴活性并计数，制备20 000个原头蚴/mL的混悬液用于泡球蚴感染小鼠造模。

1.3.2 动物模型建立 54只BALB/c小鼠随机分为3组，其中包括：泡球蚴感染实验组24只、生理盐水对照组和空白对照组各15只。使用10%水合氯醛麻醉实验组和对照组小鼠，使用医用碘伏对小鼠腹部区域进行消毒，使用医用酒精进行脱碘，区域覆盖整个腹部。在小鼠中上腹，用眼科剪暴露1个约0.5 cm切口，肉眼直视找到小鼠肝脏，在小鼠左肝最大叶注射原头蚴悬液0.1 mL/只（实验组），以建立肝泡球蚴病小鼠动物模型。对照组小鼠注射等量的生理盐水。

1.3.3 小鼠肝组织病理标本取材及HE染色 建模3个月后，开腹取材小鼠左叶肝组织，分为两部分，一部分用于RNA提取，一部分用于基础病理检测。经生理盐水冲洗及组织修整、甲醛溶液固定、梯度脱水、石蜡包埋和组织蜡块切片等实验操作，以制备肝脏病理切片。各实验组肝脏病理切片经HE染色后，光学显微镜下观察组织病理结构及拍照。

1.3.4 小鼠肝组织总RNA提取 泡球蚴感染组和生理盐水对照组小鼠肝组织，采用Trizol试剂盒提取RNA，操作步骤参考其说明书。制备好的RNA经紫外分光度检测RNA浓度和纯度，甲醛变性凝胶电泳，检测RNA的完整性。选取OD260/280约2.0和未降解的RNA样品用于miRNA芯片检测。

1.3.5 miRNAs芯片杂交、扫描肝组织miRNA检测采用哺乳动物miRNAs微阵列芯片V4.0试剂盒标记，操作步骤参考其说明书。泡球蚴感染组和生理盐水对照组小鼠肝脏RNA，经miRNA分离、miRNAs荧光标记等步骤，制备获得miRNA标记产物，将其转入到0.2 mL离心管，95°C，持续3 min使RNA变性，随后迅速将产物放置在冰上，持续2 min，瞬时离心，即可和哺乳动物miRNAs微阵列芯片杂交。杂交后进行芯片扫描、图像采集与数据分析。

1.3.6 生物信息学分析 在差异miRNA中选取差异倍数＞2.5的miRNAs（miR-21-5p、miR-148-3p、miR-191-5p、miR-192-5p、miR-223-3p和miR-494-3p），使用TargetScan（http://www.targetscan.org/）数据库预测上述miRNA的靶基因，使用David7.2数据库（https://david.ncifcrf.gov/）对目标miRNA的靶mRNA进行基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）分析，使用R3.6.2绘制图例。

2 结果

2.1 小鼠肝脏病理结果 生理盐水组和空白对照组小鼠肝叶病理结构正常，肝细胞结构完整，形态正常，未见炎性细胞浸润（图1A和1B）。感染组小鼠肝脏病灶旁可见炎性细胞带（图1C）。

图1 C57小鼠感染泡球蚴3个月肝脏HE染色结果（×200）

2.2 miRNA芯片检测结果 泡球蚴感染组和生理盐水对照组小鼠肝脏的经荧光标记的miRNA，均成功与哺乳动物miRNAs微阵列芯片杂交（图2）。与对照组相比，共发现46个具有差异表达的miRNA,其中包括29个上调miRNAs和17个下调miRNAs。进一步分析，上调差异大于2倍有19个，而下调大于2倍的有2个。从上调miRNAs中选取上调差异大于2.5倍的6个miRNA（miR-21-5p、miR-148-3p、miR-191-5p、miR-192-5p、miR-223-3p和miR-494-3p）用于下一步分析（表1）。

表1肝泡型包虫病差异表达miRNAs的上调倍数及其功能

图2泡球蚴感染组和生理盐水组小鼠肝脏miRNA芯片杂交图

2.3 miRNA芯片生物信息学分析结果 为了明确差异miRNA可能的生物学功能，利用Targetscan数据对6个差异的miRNA进行靶基因预测，选取重复出现2次以上的靶基因（n=243）进行ID转换，去除未被数据库收录的靶基因，共计235个靶基因用于GO和KEGG分析。GO分析提示靶基因与DNA结合、蛋白质结合和转录活性调节等重要细胞生物功能相关（图3A）。KEGG分析指出：靶基因与轴突引导、转化生长因子-β（TGF-β）信号通路、胞吞作用、癌症中的转录失调、磷脂酰肌醇激酶（PI3K-AKT）信号通路和表皮生长因子受体（EGFR）酪氨酸激酶抑制剂耐药等通路相关（图3B）。

图3差异miRNAs的235个靶基因的前20个GO分析（A）和KEGG通路分析（B）条目

3 讨论

miRNA在疾病致病过程中具有重要调控作用，可作为临床诊断标志物及治疗靶点。本研究在泡球蚴感染3个月小鼠肝脏中发现miR-21-5p、miR-148-3p、miR-191-5p、miR-192-5p、miR-223-3p和miR-494-3p等miRNA高表达，其靶基因主要与基因转录调控等生物学功能相关，并参与了轴突引导、TGF-β信号通路和胞吞作用等信号通路。本研究为进一步鉴定在泡球蚴感染过程中起重要作用的miRNA奠定了基础，同时发现了一些可能参与泡球蚴感染的重要基因和信号通路。

本研究发现的miR-21-5p[11]、miR-223-3p[11-12]等miRNA已在肝泡型包虫病和囊型包虫病中被报道高表达。其中miR-21-5p是在肿瘤[13]和心血管疾病[14]中促进细胞增殖并发挥重要作用的RNA，是肝癌等肿瘤的诊断标记物和干预靶标。Eroglu等[11]在囊型包虫病和泡型包虫病患者肝脏中均发现miR-21-5p高表达，然而miR-21-5p在泡型包虫病致病机制中的作用尚未鉴定。miR-223-3p在风湿性关节炎[15]和肝损伤[16]等疾病中发挥重要作用。Fuller-Carter等[17]发现miR-223-3p能调控视神经再生。另外，miR-223是睾丸癌的诊断标志物[18]。因此本研究推测miR-21-5p和miR-223-3p在泡型包虫病的致病机制中可能发挥了重要作用，可能是泡型包虫病的诊断和治疗的靶标，具有较大研究价值。

miR-148-3p、miR-191-5p、miR-192-5p和miR-494-3p在多种疾病中发挥重要作用。Li等[19]发现由miR-148-3p/FGF2信号通路组成的信号级联通路可能是预防骨性关节炎进展的潜在治疗靶点。Flammang等[20]发现在胰腺导管腺癌中miR-192-5p具有抑制肿瘤作用，可作为胰腺导管腺癌诊断和预后标志物。Lin等[21]发现miR-494-3p通过靶向PTEN（人10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因）促进PI3K/AKT通路过度活化，从而促进了肝癌病程进展。因此，这4个分子也可作为研究泡型包虫病致病机制的候选miRNA。

另外，本研究发现轴突引导、TGF-β信号通路和胞吞作用等信号通路被激活。由于泡球蚴感染导致病灶周边的肝脏纤维化，Wang等[22]已明确TGF-β信号通路在泡型包虫病肝脏中被激活。

本研究从miRNA转录组水平探讨了泡球蚴感染中发挥作用的miRNA及其调控的基因，并对这些基因的生物学功能及作用通路可能的影响进行了探讨，为阐明泡型包虫病的致病机制奠定了基础。