他克莫司治疗囊型棘球蚴病小鼠对钙磷酸调节酶和免疫因子的影响①

李锦田，木扎拜尔·木合塔尔，颜明智，吕国栋，马桂芝

（1新疆医科大学药学院，乌鲁木齐830011；2喀什地区妇幼保健院，新疆喀什844000；3新疆医科大学第一附属医院临床医学研究院，乌鲁木齐830054）

囊型包虫病（Cystic Echinococcosis，CE）是由细粒棘球绦虫（Echinococcus granulosus）幼虫引起的一种呈世界性分布的人畜共患寄生虫疾病，严重威胁生命健康并给畜牧业造成经济损失[1]。该疾病的病理学特征是主要在肝脏和肺中形成充满液体的囊肿，目前除手术外，世界卫生组织推荐阿苯达唑和阿苯达唑亚砜作为治疗包虫病的首选药物[2]。然而，这些苯并咪唑类药物杀虫的效果非常缓慢，具有吸收效果差，且需要患者长时间高剂量服药并易产生耐药性等不足[3]。因此，研发具有更高驱虫活性的药物治疗囊型包虫病非常必要。

由于mTOR信号通路具有独特的感知和整合多种不同环境和激素信号的能力，在细胞增殖、存活、自噬、代谢和免疫等多种生物过程中发挥着重要作用[4]。mTOR信号通路抑制剂主要包括雷帕霉素与其合成的类似物以及其他相关的聚酮大环内酯[5]。这些药物通过结合FK506结合蛋白(FKBPs)发挥其生物学作用，形成药物-蛋白复合物，随后与参与细胞信号转导的钙调磷酸酶和雷帕霉素靶蛋白相互作用并使其失活。据报道，细粒棘球绦虫幼虫中克隆出FK506结合蛋白（FK506-binding proteins，FKBPs）基因，与涡虫、血吸虫、多房棘球绦虫的FKBPs基因序列对发现保守结构域比较为保守[6-7]。钙调磷酸酶抑制剂TAC在体外具有抑制原头蚴活性以降低生存率并在体内具有治疗囊型棘球蚴病小鼠的效果[8-9]。TAC在临床应用中作为免疫抑制剂，通过影响T细胞分化为CD4+、CD8+和Th17效应细胞或者调节钙磷酸调节酶（Calcineurin，CaN）活性发挥其免疫抑制作用[10]。然而，TAC在治疗囊型棘球蚴病小鼠时是否通过影响了CaN含量和机体免疫因子水平来发挥抗虫活性仍未明确。因此，本研究探讨TAC治疗细粒棘球蚴感染小鼠后对其血清中免疫因子和CaN含量的影响。

1 材料与方法

1.1 实验器材 电子天平（Sartorius，美国）、离心机（Thermo scientific，美国）、流式细胞仪（FACSAriallBD，美国）、酶标仪（Thermo，美国）。

1.2 实验试剂 他克莫司药物（MedChem Express，美国）、Ca2+检测试剂盒（Cayman，美国）、钙调磷酸蛋白检测试剂盒（AssayBiotech，美国）、BD CBA人Th1/Th2/Th17细胞因子试剂盒（BD，美国）。

1.3 通过腹腔注射细粒棘球蚴建立囊型棘球蚴病C57小鼠动物模型 感染细粒棘球绦虫的羊肝购自于新疆乌鲁木齐市华凌屠宰场，在无菌的环境下，用注射器将囊液抽出，剪刀将囊壁剪碎，生理盐水清洗、过滤、沉淀后分离原头蚴，使用1%猪胃蛋白酶在37℃水浴锅中消化30 min后，PBS清洗3遍，使用1%伊红染液对获取的原头蚴进行活力检测，当其存活率95%以上，该批次原头蚴可用于小鼠腹腔造模。从维通利华购买16 g左右5周龄的雌性C57小鼠，适应性饲养1周后，每只小鼠注射100μL 2 000头新鲜原头蚴的生理盐水混悬液，每只笼子5只小鼠，饲养在新疆医科大学医学动物实验中心，12 h昼夜更替，湿度为50%，定期清理鼠笼并保持笼内清洁。

1.4 钙调磷酸酶抑制剂TAC治疗囊型棘球蚴病C57小鼠动物模型 小鼠造模4个月后，使用B超检测小鼠腹腔内是否成功生长了囊泡，将造模成功的小鼠分为5组，每组8只：溶剂组、5 mg/kg ABZ组、治疗组TAC（1 mg/kg[11-12]、2 mg/kg、4 mg/kg），药物的溶剂为0.5%的羧甲基纤维素钠与8%的吐温80的混合物，药物配制后储存在4℃冰箱中，每两天配1次药，药物的灌胃容量为0.25 mL/只，连续灌胃30 d。给药结束后，将小鼠麻醉后，进行心脏采血，脱颈处死后，取出小鼠体内囊泡，使用生理盐水清洗若干次，使用注射器将囊泡中的囊液吸出，与囊壁分别装入离心管中，-80℃冻存以便后续实验使用。

1.5 小鼠体内囊泡中钙磷酸调节酶浓度检测 根据钙调磷酸蛋白检测试剂盒操作手册对样品进行处理，用pH值为7.4磷酸盐缓冲溶液冲洗囊泡组织，在0.5～1 mL含有蛋白酶抑制剂的冷1×PBS缓冲液中匀浆2～4 min，10 000 g，4℃离心15 min，取上清液放在冰上，用稀释液将标准品分别稀释至16 ng/mL、8 ng/mL、4 ng/mL、2 ng/mL、1 ng/mL用来制作标准曲线，在96孔板中进行加样，每个样本重复2个复孔，标准样品孔和待测样本孔中分别加入标准品溶液和待测样本50μL，再加入生物素抗原工作液50μL，37℃培育箱孵育60 min。洗涤孵育结束后，每个待测孔中各加入50μL显色液A和显色液B，37℃避光显色10 min，加入50μL终止液，终止反应。在波长为450 nm下检测吸光度，根据标准曲线计算待测样本中钙磷酸调节酶的浓度。

1.6 囊泡组织钙离子浓度检测 根据Ca2+检测试剂盒操作手册对样品进行处理，使用预冷的PBS溶液冲洗囊泡囊壁3次，去除多余的组织，将囊泡组织匀浆后，10 000 g，4℃离心15 min，收集上清液，储存在冰上。将等体积的Ca2+检测物R1与Ca2+检测物R2混合涡旋制备工作液待用，在96孔板中进行加样，标准孔和样本孔各10μL，每个样本重复2个复孔，每孔加入200μL探测物试剂，轻轻涡旋混匀，室温孵育5 min，使用酶标仪在波长为570～590 nm处读取吸光度，计算待测样本中Ca2+浓度。

1.7 流式细胞仪检测小鼠血清中免疫因子含量TAC治疗囊型棘球蚴病小鼠30 d后，小鼠眼眶采血，将小鼠血液样本放室温2 h后，3 500 r/min，4℃离心15 min，取上清液，弃去溶血样本。根据试剂盒操作手册将白细胞介素-4（Interleukin-4，IL-4）、白细胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）、白细胞介素-10（Interleukin-10，IL-10）、白细胞介素-17（Interleukin-17，IL-17）、肿瘤坏死因子（Tumor Necrosis Factor，TNF)、干扰素（Interferon-γ，IFN-γ）捕获微球混合备用，将Th1/Th2/Th17细胞因子标准品在流式管用实验稀释液按梯度稀释，吹打混匀。待测样本、混合微球与Th1/Th2/Th17 PE检测试剂各50μL加入流式管中，涡旋混匀，上机检测后记录数据，使用BD™Cytometric Bead Array(CBA)FCAPArray Software v3.0软件分析处理数据。

1.8 统计学分析 应用SPSS 19.0软件进行统计分析，使用Prism 8软件对数据进行作图。本实验数据均用均数±标准差(-x±s)表示，药物治疗组与溶剂组数据比较采用t检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 囊型棘球蚴病C57小鼠动物模型囊泡组织中钙磷酸调节酶浓度 对小鼠血清和囊泡囊液中CaN的含量检测结果显示，TAC治疗组小鼠血清中的CaN含量与溶剂组比较差异无统计学意义（P＞0.05）（图1A）。但TAC能够降低囊液中CaN的含量，并且呈现出药物剂量依赖性，2 mg/kg TAC治疗组与4 mg/kg TAC治疗组囊液中CaN含量与溶剂组比较差异具有统计学意义（P＜0.05）（图1B）。

图1 TAC治疗囊型棘球蚴病小鼠后血清中CaN含量（A）与囊液中CaN含量（B）影响

2.2 囊型棘球蚴病C57小鼠动物模型囊泡组织中钙离子浓度 实验组囊壁中Ca2+含量低于囊液中Ca2+含量，TAC治疗组囊泡囊壁中的Ca2+含量与溶剂组比较差异无统计学意义（P＞0.05），同时，TAC治疗组囊泡囊液中的Ca2+含量与溶剂组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。但4 mg/kg TAC治疗组具有增加囊壁中Ca2+含量和降低囊液中Ca2+含量趋势（图2）。

图2 TAC治疗囊型棘球蚴病小鼠后囊泡囊壁与囊液中Ca2+含量变化

2.3 TAC治疗囊型棘球蚴病C57小鼠动物模型血清中免疫因子含量变化 不同剂量的TAC灌胃给药1个月后，检测小鼠血清中免疫因子的水平。如图3结果显示：4 mg/kg TAC治疗组与溶剂组血清中的IL-17、IFN-γ水平比较差异具有统计学意义（P＜0.05）；1 mg/kg TAC治疗组与溶剂组小鼠血清中IL-10水平比较差异具有统计学意义（P＜0.05），且小鼠血清中IL-10水平随着TAC给药剂量的增加有升高的趋势；4 mg/kg和1 mg/kg TAC治疗组均可增加小鼠血清中IL-17水平，并且与溶剂组比较差异具有统计学意义（P＜0.05）；TAC治疗组囊型棘球蚴病小鼠动物模型血清中的IL-6、IL-4、TNF水平与溶剂组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

图3 TAC治疗囊型棘球蚴病小鼠动物模型血清中免疫因子含量

3 讨论

囊型包虫病是一种被忽视的疾病，多发于以畜牧业为主的地区，严重危害了牲畜和人体健康，中国西部、中亚、南美、地中海国家和非洲东部是高流行地区[13]。抗肿瘤药物[14]、广谱抗感染药物[15]、中草药提取物[16]等药物在体外和体内实验中均被发现具有抗囊型包虫病的潜在作用，但运用于临床应用的药物甚少。基于临床几十年的经验和大量实验，TAC在临床上根据血药浓度监测可实现肝移植和肾移植患者个体化用药[17]。目前，TAC在肿瘤研究中具有关键作用[18]，TAC具有诱导肝癌细胞死亡和抗增殖特性[19]。在寄生虫研究领域，40～100μmol/L依维莫司在体外干预多房棘球绦虫5 d和12 d后，破坏了虫体的结构影响其生存活性[20]。前期研究发现TAC在体外能够抑制原头蚴和囊泡的生长发育，并能够降低囊型棘球蚴病小鼠体内囊泡湿重[8]，但其药理机制尚不清楚。随着深入研究，本课题组发现TAC能够显著降低囊液中CaN的含量，并影响小鼠血清中免疫因子的含量。

在原头蚴中有大量分化的细胞，这些细胞沉积的钙盐被钙特异性结合蛋白吸收，在其生长发育过程中，需要钙通道和钙泵来运输和调节钙的吸收[6]，以维持原头蚴的钙稳态[21]，支持蠕虫收缩[22-23]。Li等[24]探究原头蚴细胞内Ca2+含量是否可以作为衡量原头蚴活力的指标，在体外实验中，TAC和雷帕霉素干预后原头蚴胞浆Ca2+浓度呈药物剂量依赖性，并发现这些药物能够促使原头蚴细胞外和细胞内储存的Ca2+释放，从而影响原头蚴的活性[9]。本实验发现TAC治疗囊型包虫病小鼠后，囊液中CaN浓度降低，且存在剂量依赖的相关性。TAC给药治疗小鼠1个月后，4mg/kg TAC显著降低了囊液中CaN的含量，并且也降低了囊液中Ca2+的浓度。因此，本研究推测钙调磷酸酶抑制剂TAC通过抑制钙调磷酸蛋白酶活性，抑制细胞内储存的Ca2+释放，并降低Ca2+通道流入细胞质中，从而能够抑制小鼠体内囊泡的生长发育以发挥抗囊型包虫病的作用。

囊型包虫病患者早期临床症状不明显，可在患者体内潜伏数十年，疾病后期会引起机体免疫下调或免疫耐受[25]。IL-17在寄生虫感染早期发挥着抗炎抗虫的作用[26]，IL-17是由Th17分泌，可激活调节T细胞、成纤维细胞和内皮细胞产生IL-6，启动早期炎症反应，在囊型包虫病患者免疫反应调节中发挥重要作用[27]。IL-17在囊型包虫病早期起保护作用，但后期在细粒棘球蚴感染寄生宿主体内生长过程中，不断释放免疫活性成分，不同程度地下调免疫效应细胞，IL-17表达水平降低，以逃避宿主免疫攻击的能力，能够在体内造成持续性感染[28]。TAC通过调节钙磷酸调节酶影响调节性T细胞数量，从而调节T细胞活性，降低了T细胞相关细胞因子的分泌[29]。然而，在本研究发现4 mg/kg TAC上调了囊型棘球蚴病小鼠血清中IL-17和IFN-γ表达水平，发挥抑制囊泡在宿主体内生长的作用，但其药理机制需进一步研究。

综上所述，本研究结果表明TAC能够抑制囊液中CaN含量，可能参与了机体的调节免疫应答起到抑制囊泡生长发育的作用，且TAC能够使小鼠血清中IL-17、IFN-γ表达水平升高，恢复免疫细胞的杀伤能力。本研究提示TAC可用于治疗囊型棘球蚴病小鼠，长期给药治疗仍需进行免疫监测。