母鼠肥胖通过子鼠下丘脑SOCS3- JAK/STAT 通路影响采食量的研究

沈方方 祝峰 张大伟 张瑾 滕懿群

随着人们生活水平的提高，肥胖及其相关代谢综合征的发病率越来越高，严重威胁人类健康。越来越多的临床资料及动物实验研究表明，母亲肥胖和孕期营养过剩对胎儿及全生命周期有着深远的影响，是儿童肥胖及成年后慢性代谢疾病高发的重要原因之一[1-2]，但其机制尚未清晰。细胞因子信号转导抑制因子3（suppressor of eytokine signaling 3，SOCS3）是瘦素（Leptin）信号转导的负反馈抑制因子，对调节同代的Leptin 抵抗和能量稳态非常重要[3]，被认为是代谢性疾病的关键靶点[4]，但SOCS3对子代成年期代谢性疾病影响的相关研究报道较少。本研究通过高脂饲料喂养构建肥胖母鼠模型，观察其子鼠摄食、体重的变化，成年后下丘脑SOCS3 及Janus 激酶（JAK）-信号转导子和转录激活物（STAT）通路中关键分子的变化，探讨母鼠高脂饲料喂养对子鼠下丘脑SOCS3- JAK/STAT 通路的影响，为预防肥胖等慢性代谢综合征的发生提供新思路。

1 材料和方法

1.1 实验动物 20 只4 周龄SPF 级C57BL/6J 雌性小鼠均购自苏州大学，喂养、繁殖于嘉兴学院动物房。饲养条件为（24±2）℃，相对湿度（50±10）%，12 h/12 h 明暗循环照明。本动物实验遵照《中华人民共和国实验动物管理条例》的相关规定，并已获得嘉兴学院动物实验伦理委员会审查批准。

1.2 主要试剂及仪器 高脂饲料购自江苏南通特洛菲公司（批号：TP23300，规格：1 000 g/包）；普通饲料购自江苏南京协同生物公司（批号：1010083，规格：2 000 g/包）；Leptin 检测试剂盒购自南京建成生物公司；SOCS3、Leptin 受体（LEPR）、刺鼠相关蛋白（AGRP）及阿黑皮素原（POMC）等引物均由中国通用生物技术公司合成；Trizol、反转录试剂盒均购自日本Takara 公司；磷酸化的JAK2（P-JAK2）、JAK2 抗体均购自美国Cell Signaling公司；磷酸化的STAT3（P-STAT3）、STAT3 抗体均购自美国Santa Cruz Biotechnology 公司；SOCS3 抗体购自中国ABclonal 公司；辣根过氧化物酶（HRP）二抗及微管蛋白（tubulin）抗体均购自中国Tianjin Sungene Biotech公司。仪器多功能酶标仪（SPARK）购自瑞士TECAN 公司；普通PCR 仪购自德国Eppendorf 公司；Thermo Fisher-QS3 实时定量PCR 仪购自美国Thermo 公司；Bio-Rad 凝胶成像仪购自美国Bio-Rad 公司。

1.3 实验动物分组和建模 将20 只母鼠采用随机数字表法分为肥胖母鼠（obese mother，OM）组及非肥胖母鼠（non-obese mother，NM）组两组，每组10 只，OM 组以高脂饲料喂养，NM 组以普通饲料喂养，均自由采食、饮水。4 周后OM 组平均体重为（24.16±0.81）g，NM 组为（20.13±0.97）g，OM 组体重高于NM 组，差异有统计学意义（P＜0.05），达到建模成功标准[5]。两组母鼠均分别与全同胞健康雄鼠交配，1 雄2 雌同笼1 周后，取出雌鼠单笼饲养至产子。两组母鼠在孕期继续原饲养方案，哺乳期则均以普通饲料喂养至实验结束。每只母鼠所产子鼠随机选取1 只组成OM 组子鼠（obese mother-descent，OM-D）及NM 组子鼠（non-obese mother-descent，NM-D），每组10 只，所有子鼠出生4 周后均停止哺乳，采用高脂饲料喂养，自由采食、饮水，饲养至17 周龄。两组子鼠从4 周后开始每周称体重及每周一、三、五饲料的消耗量，持续至17 周末，计算平均日采食量。两组母鼠产子后4 周末予麻醉脱颈椎处死。OM-D 及NM-D 组子鼠全部于17 周末予麻醉，取眼球血于4 ℃保存（其中两组子鼠各8 只测定其Leptin 水平）；脱颈椎处死后取下丘脑组织（其中两组子鼠各5 只测定其mRNA 和蛋白表达水平），放入液氮速冻后，-80 °C 冰箱保存。

1.4 检测方法

1.4.1 血清Leptin 水平测定 采用ELISA 法。取子鼠眼球血1 ml，收集的全血于4 ℃隔夜放置，3 500 r/min，10 min，取上清液。最后分别按照试剂盒说明书，在酶标仪上对血清Leptin 水平进行测定。

1.4.2 SOCS3、LEPR、AGRP 及POMC mRNA 表达水平检测 采用实时定量PCR 法。采用Trizol 从子鼠下丘脑组织中提取总RNA，然后根据反转录试剂盒说明书操作，并在普通PCR 仪上反转录获得cDNA。在Thermo Fisher-QS3 实时定量PCR 仪上检测SOCS3、LEPR、AGRP 和POMC mRNA 表达水平。以肌动蛋白（β-Actin）作为内对照。实验运行方案为：变性程序（95 ℃10 min），扩增定量程序重复40 次（95 ℃15 s，60 ℃10 s，72 ℃15 s，单次荧光测量），熔化曲线程序（60～95 ℃，升温速率0.1 °C/s，连续荧光测量）。使用2-ΔΔCt方法测定相对mRNA 的表达水平。本研究使用的引物序列见表1。

1.4.3 SOCS3、P-JAK2、JAK2、P-STAT3、STAT3 蛋白表达水平检测 采用Western blot 法。采用BCA 蛋白质测定试剂盒测定子鼠下丘脑组织中总蛋白浓度，将各样本的蛋白浓度调整一致，再与1/4 体积的蛋白上样缓冲液混合后煮沸，变性；通过10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离总蛋白，转膜；在室温下用5%脱脂奶粉封闭膜2 h，稀释SOCS3、P-JAK2、JAK2、P-STAT3、STAT3 及tubulin 抗体（1∶500）, 于4 ℃过夜孵育；第2 天洗膜，用5%脱脂奶粉稀释HRP 标记的二抗（1∶1 000）于摇床上孵育90 min，洗膜后，加发光液，β-tubulin 作为内参，用Bio-Rad 成像系统曝光，目标蛋白分别与内参灰度值相比为各自蛋白表达水平。

表1 本研究所用的引物序列

1.5 统计学处理 采用SPSS 22.0 统计软件，采用Graph Pad Prism 8 进行制图。计量资料以表示，组间比较采用两独立样本t 检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组子鼠体重、采食量比较 两组子鼠4 周龄时体重比较差异无统计学意义（P ＞0.05），6、17 周龄时OM-D 组体重均明显高于NM-D 组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。OM-D 组采食量高于NM-D 组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 两组子鼠体重、采食量比较（g）

2.2 两组子鼠血清Leptin 水平比较 OM-D 组Leptin水平显著高于NM-D 组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表3。

表3 两组子鼠血清Leptin 水平比较（mmol/L）

2.3 两组子鼠SOCS3、LEPR、AGRP 及POMC mRNA 表达水平比较 OM-D 组SOCS3、AGRP、POMC mRNA 表达水平与NM-D 组比较差异均有统计学意义（均P＜0.05），而LEPR mRNA 表达水平比较差异无统计学意义（P ＞0.05）。见表4。

表4 两组子鼠下丘脑SOCS3、LEPR、AGRP 及POMC mRNA表达水平比较

2.4 两组子鼠SOCS3、P-JAK2、JAK2、P-STAT3、STAT3蛋白表达水平比较 进一步通过Western blot 法发现，OM-D 组SOCS3 蛋白表达水平显著高于NM-D 组，PJAK2/JAK2 较NM-D 组明显降低，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；OM-D 组P-STAT3/STAT3 较NM-D 组也有下降趋势，但差异无统计学意义（P ＞0.05），见图1、表5。

3 讨论

图1 两组子鼠SOCS3、P-JAK2、JAK2、P-STAT3、STAT3 蛋白表达的电泳图（SOCS3 为细胞因子信号转导抑制因子3；P-JAK2 为磷酸化的Janus 激酶2；JAK2 为Janus 激酶2；P-STAT3 为磷酸化的信号转导子和转录激活物3；STAT3 为信号转导子和转录激活物3）

表5 两组子鼠SOCS3 蛋白表达水平、P-JAK2/JAK2、P-STAT3/STAT3 比较

目前大量研究已证实，当母代进行高脂饮食产生肥胖表型时，其子代同样会出现胰岛素及Leptin 抵抗[6-9]，有动物实验显示，其机制可能与某些炎症因子如IL-1β的活性增强[10]、糖代谢调节因子表达异常[11]等有关。Yang 等[12]报道了母鼠肥胖会导致子代的锌指蛋白423（Zfp-423）启动子区域的DNA 甲基化、组蛋白的甲基化水平降低，进而导致Zfp-423 表达水平升高，诱发子代肥胖。SOCS3 是参与胰岛素及Leptin 抵抗的重要因子，抑制SOCS3 活性及其表达的药理策略可能是未来治疗肥胖症的方法之一[13-14]，因此SOCS3 在子代中的作用成为研究热点。有研究发现，携带SOCS3 缺失基因的母鼠所生的或由具有相同突变的母鼠抚养的雄性子鼠，其体重减轻、肥胖改善，并且脑质量降低[15]。张旭等[16]认为检测孕前BMI 和孕期增重对新生儿代谢特征的指标发现，孕前或孕期母亲营养过度会导致子代淋巴细胞中SOCS3 mRNA 表达水平升高，而Leptin 诱导的P-STAT3 mRNAs 表达水平降低。

下丘脑是哺乳动物调控食欲的基本部位，其内存在食欲调节神经细胞群，其中弓状核是中枢与外周循环食欲因子交换信息的重要通路。弓状核主要合成下丘脑组织神经肽Y（neuropeptide，NPY）、AGRP、POMC 等。其中NPY 及AGRP 为促食欲调节因子，而POMC 为抑制食欲因子[17]。本研究结果中，在相同饲料喂养条件下，高脂饲料喂养母鼠的子鼠较正常饲料喂养母鼠的子鼠，下丘脑的摄食基因发生明显变化，促食基因AGRP mRNA表达水平增加，而抑食基因POMC mRNA 表达水平下降，这与OM-D 组采食量增加的结果是相吻合的。说明母代高脂饲料喂养可以影响子代的摄食基因的表达，从而影响子代的食欲及体重。

AGRP 和POMC 的释放受神经内分泌系统调节，其中Leptin 是重要的一个因子。Leptin 与LEPR 的结合可激活LEPR，减少食物摄入，同时增加能量消耗。但是大多数肥胖者均存在Leptin 抵抗[18]。本研究也发现高脂饲料喂养母鼠的子代LEPR mRNA 表达水平无明显变化，但其Leptin 水平明显增加，说明子代存在Leptin 抵抗。

Leptin 发挥抑制食欲的作用是通过与下丘脑的LEPR 结合，通过JAK2 和STAT3 的磷酸化，激活JAK/STAT 通路。在肥胖个体中，SOCS3 是JAK/STAT 通路的负反馈抑制因子，对抑制Leptin 信号起着主要作用[19]。研究表明，下丘脑中SOCS3 mRNA 表达水平降低，小鼠空腹胰岛素及葡萄糖水平较低[20]。

本研究证实，子鼠在相同饲料喂养条件下，17 周末时OM-D 组较NM-D 组下丘脑中SOCS3 mRNA 表达水平明显增加；进一步通过Western blot 分析发现，OMD 组下丘脑中SOCS3 蛋白表达水平增加，STAT3 蛋白表达水平明显减少，且P-STAT3 蛋白表达水平和PJAK2 蛋白表达水平也明显降低。从而推断，母鼠营养过剩会导致子代成年期下丘脑SOCS3 蛋白表达水平升高，进而抑制了JAK/STAT 信号通路，产生Leptin 抵抗，导致子鼠促食基因AGRP mRNA 表达水平增加，而抑食基因POMC mRNA 表达水平下降，采食量增加，进而成年期发生肥胖等慢性代谢性疾病。

综上所述，通过构建营养过剩的小鼠模型，发现子鼠成年期下丘脑中SOCS3 蛋白表达水平增加，抑制了Leptin-JAK/STAT 信号通路，下丘脑中的抑食激素POMC mRNA 表达水平降低，促食激素AGRP mRNA 表达水平增加，从而导致子鼠采食量增加及成年期肥胖的发生，这可能是母代营养过剩导致子代发生肥胖的机制之一。成年期的肥胖、糖尿病等慢性代谢性疾病病因复杂，如何早期干预一直备受关注。本研究对孕母高脂饮食、子代肥胖和SOCS3 三者之间的关系进行了探讨，为预防孕母肥胖、胎儿营养过剩和慢性代谢疾病的发生提供了理论依据和方向。