粪便23S rRNA 基因检测判断幽门螺杆菌感染及克拉霉素耐药性的临床价值

徐华 梁军才 郭锋 吴芳 金洁

幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，Hp）是引发慢性胃炎、胃溃疡的重要致病菌，也是引发黏膜相关淋巴组织淋巴瘤以及胃癌的Ⅰ类致癌因子[1]。有研究指出，多数上消化道疾病患者存在Hp 感染[2]，施行Hp 根除治疗对这些患者有良好疗效[3]。目前，Hp 对克拉霉素的耐药率在15%～20%，且呈上升趋势[4-6]。因此，采用含克拉霉素的Hp 根除治疗方案必须了解地区人群对克拉霉素的耐药性。目前，Hp 感染及耐药性检测方法有侵入性和非侵入性两类。经典的侵入性检测为内镜下采集胃黏膜组织进行Hp 培养及药敏试验，这是检测Hp 感染及耐药性的“金标准”。然而Hp 培养条件要求高，难度大，检测时间长，同时因其具有侵入性，儿童、老人以及部分有其他严重疾病的患者难以承受。粪便23S rRNA 基因检测是最受推荐的非侵入性检测方法[7]。通过非侵入性方法采集患者的粪便样本，提取核酸后对Hp 23S rRNA 可变区（V 区）基因进行扩增及测序分析，可以实现对感染的Hp克拉霉素耐药率的检测。本研究以胃黏膜组织培养及药敏试验为对照，探讨粪便23S rRNA 基因检测判断Hp感染及克拉霉素耐药性的临床价值。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2018 年1 至12 月杭州市萧山区第一人民医院收治的上消化道疾病且需行胃镜检查的患者86 例。其中男47 例，女39 例，年龄30～70（52.29±7.35）岁；慢性浅表性胃炎患者36 例，胆汁反流性胃炎患者23 例，慢性浅表性胃炎伴糜烂患者17 例，慢性萎缩性胃炎患者10 例。纳入标准：13C 呼气试验阳性，1 个月内未服用过抗生素、铋剂、H2受体拮抗剂或质子泵抑制剂，未接受过Hp 根除治疗，无胃黏膜活检禁忌（凝血功能障碍，服用抗凝药等）。本研究经本院医学伦理委员会批准，所有患者均知情同意。

1.2 样本采集 胃黏膜组织采样：患者内镜检查时，于胃窦或炎症病灶附近采集胃黏膜组织一份，置于含脑心浸液（英国OXOID 公司，CM1135，500 g）的保存管中，作好标记，-20 ℃保存。粪便样本采样：患者内镜检查前1 d 于干净的蹲便器无水处排便，用取样勺挖取没有接触空气的粪便3 g 左右，置于含0.9%氯化钠溶液的保存管中，作好标记，-20 ℃保存。

1.3 胃黏膜组织培养及药敏试验 胃黏膜组织常温解冻后，经研磨处理，接种于哥伦比亚血琼脂培养基（英国OXOID 公司，CM0935，500 g）上，37 ℃微需氧环境下培养2～3 d。挑取培养长出的疑似菌落，使用革兰染色试剂（北京陆桥技术股份有限公司，CM1001，10 ml×4）进行染色后镜检，其中革兰染色为红色，显微镜下观察细菌呈螺旋状、S 形或海鸥状等不规则状者再经尿素酶（中国海博生物技术有限公司，GS004，20 支）、氧化酶（北京陆桥技术股份有限公司，M-153，20 支）和过氧化氢酶（中国海博生物技术有限公司，HB8650，20 支）试验验证后，可判定为Hp 培养阳性。采用平板掺入法对培养的Hp 菌株进行克拉霉素药敏试验。克拉霉素标准品购自北京科展生物科技有限公司（S17135-1g，纯度98%，1 g）。克拉霉素耐药临界值为1 μg/ml。

1.4 粪便核酸提取及基因测序 粪便样本常温解冻后，采用天根粪便基因组提取试剂盒（中国天根生化科技有限公司，DP328，50 次）提取核酸。采用巢式PCR 技术进行Hp 23S rRNA 功能V 区目的片段的扩增。扩增引物见表1。第1 步PCR 扩增以提取的粪便核酸为模板，23S-1F 和23S-1R 为引物，扩增出一段617 bp 基因片段。第2 步PCR 扩增以第1 步扩增产物为模板，23S-2F 和23S-2R 为引物，得到最终目的产物，基因片段长度425 bp。将得到的23S rRNA 目的片段进行Sanger 测序。测序结果与国际标准敏感Hp 菌株U27270（Accession No：U27270）进行比对，分析2142、2143 两个位点基因突变情况，两个位点碱基均为腺嘌吟时则判断为对克拉霉素敏感；任一位点突变为鸟嘌呤时即判断为耐药（图1）。

表1 Hp 23S rRNA 及16S rRNA 基因的扩增引物

图1 粪便23S rRNA 基因检测突变情况（2142、2143 位点）

1.5 16S rRNA 高通量测序 采用核酸定量仪（美国Thermo Fisher Scientific 公司，Qubit 2.0）对提取的粪便样本核酸浓度进行定量分析，采用生物分析仪（美国Agilent Technologies 公司，Agilent 2100）对核酸分子完整性进行评价。质检合格的样本采用引物16S-F 和16S-R 扩增Hp 16S rRNA V3-V4 区。扩增产物经磁珠纯化后，采用带测序接头的引物进行再次扩增。扩增产物再次经磁珠纯化、文库浓度及质量检测合格后，采用Illumina Miseq 高通量测序平台进行测序。测序后的原始数据进行拼接、过滤后得到有效的测序数据。之后，对有效数据进行操作分类单元聚类和物种注释分类分析，可得到样本中各物种的丰度分布情况。

1.6 统计学处理 采用SPSS 19.0 统计软件。计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。一致性分析采用Kappa 检验，Kappa 值≤0.20 说明一致性强度较差，0.20＜Kappa 值≤0.40 说明一致性强度一般，0.40＜Kappa 值≤0.60 说明一致性强度中等，0.60＜Kappa 值≤0.80 说明一致性强度较强，0.80＜Kappa 值＜1.00 说明一致性强度强。

2 结果

2.1 胃黏膜组织培养与粪便23S rRNA 基因检测Hp阳性率及克拉霉素耐药率比较 本研究共收集86 份胃黏膜样本，胃黏膜组织培养及粪便23S rRNA 基因检测Hp 阳性率及克拉霉素耐药率比较见表2。粪便23S rRNA基因检测第1 步PCR 扩增阳性52 份，扩增率为60.47%；第2 步PCR 扩增阳性68 份，扩增率为79.07%。粪便23S rRNA 基因检测检出Hp 的阳性率高于胃黏膜组织培养法的阳性率，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 胃黏膜组织培养与粪便23S rRNA 基因检测检出Hp 及对克拉霉素耐药的灵敏度和特异度比较 胃黏膜组织培养的56 份Hp 阳性样本中，粪便23S rRNA 基因检测检出Hp54 份，其灵敏度为96.43%（54/56）；胃黏膜组织培养的30 份Hp 阴性样本中，粪便23S rRNA 基因检测检出Hp16 份，其特异度为53.33%（16/30）；见表3。粪便23S rRNA 基因检测与药敏试验检出对克拉霉素耐药Hp 的比较见表4。药敏试验结果对克拉霉素耐药的13 株Hp 中，粪便23S rRNA 基因检测检出12 株耐药，检测的灵敏度为92.31%（12/13）。药敏试验结果对克拉霉素敏感的41 株Hp 中，粪便23S rRNA 基因检测检出32 株敏感，特异度为78.05%（32/41）。以进行药敏试验的54 株Hp 为对照，粪便23S rRNA 基因检测结果与其一致的有44 株，对克拉霉素耐药结果检测的一致率为81.48%（44/54），Kappa 值为0.581，提示两种检测方法一致性中等。

表2 胃黏膜组织培养及粪便23S rRNA 基因检测Hp 阳性率及耐药率比较[例（%）]

2.3 粪便23S rRNA 基因检测假阴性样本16S rRNA 高通量测序验证 针对2 份粪便23S rRNA 扩增失败的核酸样本进行16S rRNA 高通量测序。2 份粪便样本Top10 微生物组成见表5。结果显示普氏菌属（Prevotella）、拟杆菌属（Bacteroides）以及粪杆菌属（Faecalibacterium）在粪便菌群中丰度较高，这3 种菌属的总丰度达到了粪便菌群总丰度的50%以上。在这2 例患者的粪便样本中均检出了螺杆菌属（Helicobacter），但其在粪便菌群中丰度相对较低，分别为0.72%和0.81%。

表3 胃黏膜组织培养与粪便23S rRNA 基因检测检出Hp 结果比较（例）

表4 药敏试验与粪便23S rRNA 基因检测对克拉霉素耐药的检测结果比较（例）

表5 粪便23S rRNA 基因检测假阴性的粪便样本中TOP 10微生物组成（%）

3 讨论

本研究招募上消化道疾病患者行胃镜检查，采集胃黏膜标本进行胃黏膜组织培养及药敏试验的同时，收集粪便样本进行粪便23S rRNA 基因扩增及测序，探讨粪便23S rRNA 基因检测Hp 感染及克拉霉素耐药性的临床价值。

常规Hp 培养阳性率在40%左右[3，5]，经13C 呼气检验阳性的患者Hp 培养阳性率有所提高。本研究中经13C 呼气检验阳性患者，胃黏膜组织培养阳性率为65.12%（56/86），而粪便23S rRNA 基因检测的阳性率为79.07%（68/86），显著高于胃黏膜组织培养。Luo 等[8]的研究结果中，粪便23S rRNA 基因检测Hp 阳性率可达到80%以上，指出通过非侵入方法采集粪便样本进行Hp 检测具有较高的阳性率。胃黏膜组织培养阳性率受到培养条件、取样部位以及胃内其他微生物污染等多方面因素的影响。有研究指出，单部位胃黏膜取样培养阳性率较低，多部位胃黏膜联合取样可以提高阳性率，胃窦小弯和胃体组织联合采样培养阳性率甚至可以达到90%以上[9]。另一方面，胃黏膜组织中的其他细菌，例如变形杆菌等，因其具有迁徙生长性，培养过程中菌苔不断扩展[10]，极容易造成培养平板污染，从而无法分离出Hp，降低培养阳性率。粪便23S rRNA 基因检测通过设计特异性引物，从待检测样本中特异性检出目的基因片段，降低其他杂菌影响。同时巢式PCR 技术的二次扩增能够提高目的基因片段浓度，检出含量相对较低的Hp，提高阳性率。秦召等[11]采用巢式PCR 技术检测小麦中的Alternaria alternata，DNA 最低检测浓度可达50 pg/μl。然而粪便中微生物种类丰富、成分复杂，当Hp 相对丰度极低时，可能会抑制后续反应[12]，影响粪便23S rRNA基因检测的灵敏度。本研究中有2 例患者胃黏膜组织培养阳性，粪便23S rRNA 基因扩增阴性。补充16S rRNA高通量测序后发现，这两份粪便样本中均检出了Hp，然而相对丰度均低于1%。

大环内酯类抗生素能结合在Hp 23S 亚基上，抑制细菌肽链延伸及蛋白合成。当23S rRNA V 区基因发生突变时，与大环内酯类抗生素结合部位结构改变可能导致结合力降低，减弱抗生素抗菌效果，产生耐药。目前已检测出的23S rRNA V 区基因突变位点有A2142C、A2142G、A2143G、A2144 G、T2183 C、T2182C、A1821G、G2224A、C2245T、T2289C、G1826A、T1830C、G1940A等[13-14]。A2142G/C、A2143G 是最常见的突变，且被认为是与克拉霉素耐药相关的突变[15]，其中任一位点突变即可判断为耐药。本研究中，粪便23S rRNA 基因测序总突变率为32.35%（22/68），其中13.64%（3/22）为A2142G突变，86.36%（19/22）为A2143G 突变，突变以A2143G突变为主，与国内克拉霉素突变位点一致[16]。Hp 药敏试验的耐药率为23.21%（13/56），高于江浙地区耐药率[4-6]。粪便23S rRNA 基因测序的耐药率高于药敏试验的耐药率，耐药一致率为81.48%（44/54）。环境因素、药物外排作用、核糖体蛋白修饰、相关代谢酶失活等因素均可能会影响耐药基因与表型的一致性。Chen 等[17]研究的111 株Hp 23S rRNA 基因测序结果与表型之间有95%的一致性。而季雪良等[18]的研究中测序组克拉霉素耐药率高达52.17%，显著高于药敏组，指出可能有其他基因同时作用，影响Hp 对抗生素的耐药性。因此，相较于药敏试验，粪便23S rRNA 基因检测拥有较高的灵敏度，但可能出现耐药假阳性，降低检测方法特异度。

通过粪便23S rRNA 基因检出可以检出Hp 感染情况，其阳性率高于常规胃黏膜组织培养，具有较高的灵敏度。同时，笔者检测出了与克拉霉素相关的A2142G与A2143G 突变，与药敏结果相比，灵敏度较高，但特异度相对较低。由于粪便23S rRNA 基因检测检出Hp 有较高的阳性率，而且对检出具有克拉霉素耐药基因的Hp 也有较高的灵敏度，因此可用于对胃镜检查不耐受患者，或13C 呼气试验阳性而胃黏膜组织培养阴性患者的Hp 感染以及克拉霉素耐药性判断。