FAK 抑制剂PF573228 负调控CD15s 抑制肝癌细胞侵袭的作用机制研究

华宏军 陈萍 叶晓华 丁进

肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是临床上常见的恶性肿瘤之一，也是全世界死亡率最高的癌症之一。在所有新发癌症病例当中，HCC 病例占将近5.7%，全球范围内每年约有1%患者的死因与HCC 相关[1-2]。HCC具有恶性程度高、病情进展快、患者生存期短等特点，因此其病死率居高不下[3]。临床上由于HCC 细胞易发生侵袭与转移从而导致HCC 在确诊时往往已发展到晚期，这也是手术和介入治疗HCC 失败的根本原因。

相关研究表明，黏着蛋白激酶（focal adhesion kinase，FAK）在肺癌、卵巢癌、乳腺癌、HCC、结直肠癌等多种肿瘤中均处于高表达和过度活化的状态，在细胞之间及细胞与细胞外基质黏附侵袭中起着重要作用，同时与肿瘤细胞生存、增殖、凋亡、周期调控、迁移等有着密切关系[4-5]。PF573228 是目前研究较多的一种ATP 竞争的FAK 抑制剂，具有高效、高特异性的特点[6-7]。本课题组前期研究发现，FAK 抑制剂PF573228 能够影响非小细胞肺癌细胞系A549 的增殖及克隆的形成[8]。尽管FAK作为肿瘤靶点在多种癌症中机制相对明确，然而在HCC 中，新型竞争性抑制剂PF573228 抗肿瘤效果及其作用机制有待深入研究。基于前期的研究基础，本项目拟探讨FAK 抑制剂PF573228 对HCC 的抑制效果以及作用机制，为其临床应用提供实验数据并奠定理论基础。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 细胞系与培养方式 人HCC 细胞系（HepG2 和SMMC-7721）均购自美国ATCC 细胞库；DMEM 细胞培养基购自美国Thermofisher 公司，细胞培养条件为含10%FBS 的DMEM，5%CO2和37 ℃培养。在无菌条件下用0.25%胰酶消化，在显微镜下观察到80%的细胞形态开始变圆时，取2 ml 细胞培养液加入细胞培养瓶中终止消化，重悬细胞备用。

1.1.2 抗体 FAK 抗体、磷酸化FAK（FAK 397）抗体均购自美国CST 公司，CD15s、钙黏附蛋白E（E-Cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、GAPDH、辣根过氧化物酶（HRP）标记羊抗鼠抗体（SA00001-1）、HRP 标记羊抗兔抗体（SA00001-2）均购自美国PTG 公司。

1.1.3 试剂盒 PF573228 购自上海MCE 公司；FastKing RT Kit（With gDNase）购自北京天根生化科技有限公司；RAPI 裂解液购自上海碧云天生物技术有限公司；Matrigen 基质胶购自美国BD 生物公司；CCK-8 细胞活性检测试剂盒购自日本东仁化学科技有限公司；ECL 试剂盒购自杭州宝科生物有限公司

1.2 实验方法

1.2.1 细胞分组 HepG2 细胞和SMMC-7721 细胞均培养至对数生长期进行实验，具体分组：将HepG2 细胞和SMMC-7721 细胞加入等量不同浓度PF573228 处理（终浓度分别为0、0.01、0.1、1、10 μM）；另对HepG2 细胞和SMMC-7721 细胞转染pcDNA-CD15s 质粒进行过表达处理，分为pcDNA-CD15s 组、PF573228 组、PF573228+pcDNA-CD15s 组。

1.2.2 pcDNA-CD15s 质粒构建 引物扩增CD15s 全长Forward primer：限制性内切酶（BamHI）-CGGGATCCATGAGGCGCTTGTGGGGCGCG Reverse primer：限制性内切酶（XhoI）-CCCTCGAG-TCACCGCTCGAACCAGCT，通过BamHI 和XhoI 双酶切pcDNA 和CD15s，回收得到待连接片段，以pcDNA 和CD15 比例为1∶5，16 ℃过夜酶连，转化，氨苄青霉素筛选单克隆，送测序，确定pcDNA-CD15s 构建成功，用内毒素质粒提取试剂盒进行质粒提取。其中H-pcDNA-EGFP、S-pcDNA-EGFP 分别为HepG2 细胞和SMMC-7721 细胞的空白质粒载体，H-pcDNA-CD15s、S-pcDNA-CD15s 分别为HepG2 细胞和SMMC-7721 细胞的CD15s 质粒载体。

1.2.3 细胞相对活力检测 采用CCK-8 法。HCC 细胞以1×104个/孔植入96 孔板中，培养48 h 后，加入CCK-8 溶液（20 μl/孔），37 ℃培养2 h，使用酶标仪测定450 nm 波长下各孔光密度（OD）值。细胞相对活力=（实验组OD 值-空白组OD 值）/（对照组OD 值-空白组OD 值）。

1.2.4 细胞侵袭能力检测 采用Transwell 小室实验。取处对数生长期的HCC 细胞接种于6 孔板中。用不含血清的DMEM 稀释matrigel 基质胶，使用冷却过的枪头，在24 孔上小室中加入50 μl 稀释过的基质胶，在37 ℃培养箱中放置0.5 h 待用，计数1×105个/孔的HCC 细胞植入24 孔cornning 上小室中，在下小室中加入20%FBS，培养8 h 后用棉签擦去上小室的基质胶，把上小室放入结晶紫溶液中染色30 min，用PBS 洗两次，放入新24 孔板中，随机选取5 个视野计数穿膜细胞数，每组设3 个复孔，取平均值。

1.2.5 总RNA 提取和cDNA 合成 收取转染或者PF573228 处理后的细胞，用1 ml Trizol 试剂裂解5 min，离心后加入200 μl 氯仿，混匀15 min，4 ℃离心取上层水相，加入等体积异丙醇沉淀10 min，4 ℃离心，用75%乙醇溶液洗1 次，干燥加水溶解，Nanodrop2000 定量，取1 μg RNA，根据天根反转录试剂盒，合成cDNA，10 倍稀释。

1.2.6 CD15s 相对表达量检测 采用荧光定量PCR法。取1 μl 稀释后的cDNA 样本，使用SYBR GREEN 法对基因进行定量分析。转染效率的验证：以空白质粒载体pcDNA-EGFP 作为对照，对CD15s 质粒（pcDNA-CD15s）进行定量分析，判断质粒是否成功转染至靶细胞。引物：细胞周期依赖性激酶抑制因子Forward primer：TGTCCGTCAGAACCCATGC，Reverse primer：AAAGTCGAAGTTCCATCGCTC；细胞周期蛋白E Forward primer：AAGGAGCGGGACACCATGA，Reverse primer：ACGGTCACGTTTGCCTTCC；细胞周期蛋白D1 Forward primer：GCTGCGAAGTGGAAACCATC，Reverse primer：CCTCCTTCTGCACACATTTGAA；细胞黏附分子CD15s Forward primer：GATCTGCGCGTGTTGGACTA，Reverse primer：GAGGGCGACTCGAAGTTCAT；FAK Forward primer:GCTTACCTTGACCCCAACTTG，Reverse primer：ACGTTCCATACCAGTACCCAG；GAPDH Forward primer:GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT，Reverse primer：GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG。

1.2.7 不同处理组E-Cadherin、Vimentin、FAK、FAK397及CD15s 蛋白表达水平检测 采用Western blot 法。收集106个细胞/样本加入50 μl RIPA 裂解液，冰上裂解30 min，离心后将上清液转移至新EP 管中，测浓度，并加入10 μl 6×loading buffer 混匀，95 ℃加热5 min，-80 ℃环境储存。取20 μl 储存的溶液加入10%的PAGE胶后上样，待蓝色loading buffer 跑至底部进行转膜，转膜条件为200 mA，3 h 转膜完毕后，取膜用TBS 洗两遍，在5%脱脂奶粉的TBST 中封闭1 h，根据目的条带进行切膜，根据抗体说明书稀释一抗，并在4 ℃摇床上孵育过夜，用TBST 洗两遍，在室温下孵育二抗，用TBST 洗3 次，20 min/次。使用宝科生物ECL 试剂盒，A、B 溶液1∶1 混合，用伯乐凝胶成像系统进行显影、分析。

1.3 统计学处理 采用SPASS 18.0 统计软件。计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析或双因素方差分析，两两比较采用LSD-t 检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度PF573228 处理组HCC 细胞相对活力比较 CCK-8 实验发现，随着PF573228 浓度增加，两种HCC 细胞相对活力均逐渐降低，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见图1。

图1 不同浓度PF573228 处理组肝癌细胞相对活力比较

2.2 不同处理组HCC 细胞侵袭数比较 Transwell 侵袭实验中，发现HCC 细胞侵袭数随PF573228 药物浓度的升高而降低，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表1、图2（插页）。另外，PF573228 组与pcDNA-CD15s 组相比，细胞侵袭数显著降低，而PF573228+pcDNACD15s 组与PF573228 组相比，细胞侵袭数有所回升，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表2、图3（插页）。

表1 不同浓度PF573228 处理组HepG2、SMMC-7721 细胞侵袭数比较（个/HP）

2.3 HepG2、SMMC-7721 细胞CD15s 相对表达量比较 与H-pcDNA-EGFP 组、S-pcDNA-EGFP 组比较，H-pcDNA-CD15s 组、S-pcDNA-CD15s 组中CD15s 相对表达量均明显增加，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表3。

表2 3 组肝癌细胞侵袭数比较（个/HP）

表3 两组肝癌细胞CD15s 的相对表达量比较

2.4 不同处理组E-Cadherin、Vimentin、FAK、FAK397及CD15s 蛋白表达水平比较 Western blot 实验结果显示，E-cadherin 蛋白表达水平随PF573228 药物浓度的升高而增加，而Vimentin 蛋白表达水平随药物浓度的升高而降低，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见图4、5。而FAK397 及CD15s 蛋白表达水平均随PF573228药物浓度的升高而不断下降，差异均有统计学意义（均P＜0.05），不同浓度组FAK 蛋白表达水平比较差异无统计学意义（P ＞0.05），见图6、7。进一步对细胞转染pcDNA-CD15s 质粒进行过表达处理，发现与PF573228组比较，PF573228+pcDNA-CD15s 组E-cadherin 蛋白表达水平有所降低，Vimentin 蛋白表达水平有所增加，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见图8。

3 讨论

目前，基于FAK 信号通路的小分子抑制剂已应用于临床，如FAK 抑制剂11-epi-SA 在HCC 细胞HA22T上能够抑制细胞外信号调节激酶（ERK1/2）、丝裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）和FAK/磷脂肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（FAK/PI3K/AKT/mTOR）信号通路进而抑制细胞转移，从而发挥抗HCC的作用[9]。另一种FAK 抑制剂PF562271 能够在小鼠模型中抑制乳腺癌的生长和转移，体外实验中能够抑制肺癌细胞的生长[10]。然而相比于上述FAK 抑制剂，以Y397为靶点的FAK 抑制剂PF573228 比富含脯氨酸的酪氨酸激酶2、周期蛋白依赖性激酶1/7 和糖原合成酶激酶-3β 的选择性更高，效率高达50～250 倍，对肿瘤临床治疗具有更好的效果。

图4 不同浓度PF573228 处理组E-Cadherin、Vimentin 蛋白的电泳图（E-Cadherin 为钙黏附蛋白E；Vimentin 为波形蛋白）

图5 不同浓度PF573228 处理组E-Cadherin、Vimentin 蛋白表达水平比较（E-Cadherin 为钙黏附蛋白E；Vimentin 为波形蛋白）

图6 不同浓度PF573228 处理组FAK、FAK397 及CD15s 蛋白表达的电泳图（FAK 为黏着蛋白激酶；FAK397 为磷酸化黏着蛋白激酶）

图7 不同浓度PF573228 处理组FAK、FAK397 蛋白表达水平比较（FAK 为黏着蛋白激酶；FAK397 为磷酸化黏着蛋白激酶）

图8 各组间E-Cadherin、Vimentin 蛋白表达的电泳图（E-Cadherin为钙黏附蛋白E；Vimentin 为波形蛋白）

肿瘤细胞的侵袭及转移被认为与MAPK 信号通路相关。MAKP 属于丝氨酸/苏氨酸激酶，由多个亚家族组成，其中较为明确的是在细胞功能中发挥重要作用的ERK1/2、c-Jun N 端激酶（JNK）以及p38MAPK。MAPK信号系统，主要由MAPK、MAPK 激酶（MAPKK）、MAPKK激酶（MAPKKK）等3 类保守的蛋白激酶组成，通过级联反应不断磷酸化下游靶蛋白最终激活MAPK[11-12]。磷酸化的MAPK 使细胞质与细胞核内转录因子活化、相应的目标基因转录及表达，从而参与和调控细胞的生长发育、存活、分裂、凋亡、自噬等生物过程，与此同时MAPK也能活化下游通路的蛋白激酶，参与相应的生物活动过程。相关研究表明[13]，p38MAPK 信号转导通路的激活可以抑制肿瘤细胞的侵袭和抗肿瘤血管的生成，而JNK信号通路的活化与肿瘤的发生、发展亦存在十分密切的关系。MAPK 信号通路可影响细胞外基质的降解是其主要机制之一，同时其还可影响肿瘤转移过程的多个环节。MAKP 信号通路是FAK 影响细胞迁移和侵袭关键的下游信号通路。有研究发现，复发转移乳腺癌中，埃兹蛋白、FAK 能够协同作用激活ERK/MAPK 通路[14-15]；在结直肠癌组织中，酪氨酸专一性蛋白激酶（Src）、FAK、JNK呈高表达，和肿瘤的分化程度呈负相关，且Scr、JNK 的表达与FAK 呈正相关，这提示FAK/Src/JNK 信号通路在结直肠癌的发生、发展中起着重要作用[16-17]。此外，细胞黏附分子在肿瘤细胞的侵袭和转移过程中发挥着双重作用，一方面肿瘤细胞必须先通过黏附分子的下调，继而从原发灶脱落；另一方面又需要通过细胞外基质受体或内皮细胞配体的上调，继而与细胞外基质受体或内皮细胞黏附而移动，才能形成转移灶。CD15s 是近些年来发现的与肿瘤恶性发展有直接相关的黏附分子。CD15s 抗原是单唾液酸神经节糖苷脂CA19-9 的同分异构体，是黏附分子选择素（CD62）所识别的较确定的一个配基。CD15s 是一种新的肿瘤相关抗原，在结肠癌、肝细胞癌、乳腺癌和甲状腺癌等多种肿瘤细胞表面表达明显增强，并且与肿瘤的发生、发展、侵袭转移和患者预后有着密切相关[18-20]。E-cadherin 是钙黏附蛋白分子家族中跨膜蛋白亚型的黏附因子的一员，其相对分子质量为120 KDa，由细胞外肽段、跨膜区和细胞内肽段构成，主要存在于人和动物的上皮细胞中。E-cadherin 的嗜同性特异黏附作用主要是细胞间的E-连接素的胞外段共同形成“拉链”结构的黏附链接。在细胞膜上β-连环蛋白与E-cadherin 组成复合体，β-连接素和γ-连接素保持细胞的特性，维护上皮细胞的结构完整性和形态具有重要作用。通过对HCC、胃癌、前列腺癌、大肠癌、鼻咽癌、结直肠癌及甲状腺癌等肿瘤的研究证实，肿瘤的分化、侵袭和转移与E-cadherin 表达降低有着十分密切的联系[21-22]。因此深入研究HCC 细胞侵袭和转移能力的机制并以此为基础探索防治HCC 的有效措施具有十分重要的意义。

综上所述，探讨PF573228 对FAK 和CD15s 蛋白的相互作用对深入研究其抑制HCC 转移的机制具有重要作用，这也将成为本课题组今后研究的重点方向。