大肠癌组织中PGAM1和mTOR的表达及其临床意义

杨永志 陈炜

大肠癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，同时也是癌症相关死亡的主要原因。目前，尽管大肠癌的诊断和治疗策略已取得了很大的进步，但由于其高发病率和高死亡率，大肠癌仍是严重危害公共健康的疾病[1-2]。因此，发现大肠癌发生、发展过程中的关键生物标志物，为大肠癌的诊断和治疗开辟更有效的靶点成为目前研究的热点。磷酸甘油酸突变酶1（phosphoglycerate mutase 1，PGAM1）是一种重要的糖酵解酶，可在糖酵解途径中催化3-磷酸甘油酸酯转化为2-磷酸甘油酸酯[3]。PGAM1通常在脑、肝和肾组织中表达，近年来的研究发现，PGAM1 在神经胶质瘤[4]、乳腺癌[5]、口腔鳞状细胞癌[6]等多种恶性肿瘤中存在过表达，并与肿瘤细胞的迁移、增殖和凋亡有关。PGAM1 高表达可激活蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）/雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信号通路诱导的Warburg 效应，促使肿瘤细的增殖，抑制其凋亡[7]。本研究采用免疫组化En Vision 法检测PGAM1 和mTOR 蛋白在大肠癌和相应癌旁组织中的表达情况，分析其表达与大肠癌临床病理特征的关系及两种蛋白表达的相关性，初步从蛋白水平探讨PGAM1 和mTOR 表达改变与大肠癌发生、发展的关系。

1 材料和方法

1.1 临床资料 选取2015 年1 月至2018 年12 月临海市第一人民医院手术切除的大肠癌标本60 例，所有标本术后均经病理检查诊断为大肠癌，术前均未接受化疗、放疗及免疫治疗等。60 例大肠癌患者中，男34 例，女26 例，年龄33～77（58.72±10.61）岁。组织学分级：高、中分化39 例，低分化21 例；参照2010 年美国癌症联合委员会/国际抗癌联盟制订的TNM 分期标准：Ⅰ期和Ⅱ期28 例，Ⅲ期和Ⅳ期32 例；淋巴结转移情况：有转移者18 例，无转移者42 例；所有患者均有完整的临床病理资料。同时取患者的癌旁组织（距肿瘤原发灶＞5 cm）作为对照，病理检查诊断为正常大肠组织。本研究经本院医学伦理委员会批准，所有患者及家属均知情同意。

1.2 主要试剂 羊抗人PGAM1 多克隆抗体和兔抗人mTOR 多克隆抗体均购自英国Abcam 公司；EnVision 通用试剂盒及二氨基联苯胺（DAB）显色剂均购自上海基因科技有限公司。

1.3 检测方法 所有组织标本离体后迅速用10%中性甲醛溶液固定，常规脱水、石蜡包埋保存。制作4 μm 厚的石蜡切片，常规切片后烤片、二甲苯脱蜡，梯度乙醇溶液脱水。采用En Vision 二步法进行免疫组化染色，严格按照试剂盒说明书进行操作。0.1 mmol/L 枸橼酸盐缓冲液高压抗原修复，正常山羊血清封闭30 min，一抗4 ℃冰箱过夜，二抗孵育30 min，显微镜下观察，中性树胶封片。用已知阳性片做阳性对照，以PBS 液代替一抗做阴性对照。

1.4 结果判定 PGAM1 和mTOR 均以细胞质内出现淡黄色至棕褐色颗粒为阳性信号。在光学显微镜下，每张切片随机选取5 个高倍视野（×400），观察并记录细胞染色强度：无显色为0 分，淡黄色为1 分，棕黄色为2分，棕褐色为3 分。记录阳性细胞数的百分比：阳性细胞数百分比≤25%为1 分；26%～50%为2 分；51%～75%为3 分；＞75%为4 分。两项计分的乘积为每张切片的最终积分，最终积分＜3 分为阴性，≥3 分为阳性。

1.5 统计学处理 采用SPSS 19.0 统计软件。计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验；相关性分析采用Spearman 秩相关。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大肠癌和癌旁组织中PGAM1 和mTOR 阳性表达率比较 PGAM1 和mTOR 在大肠癌组织中的阳性表现见图1、2（插页）。大肠癌组织中PGAM1 和mTOR 的阳性表达率均明显高于癌旁正常组织，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表1。

表1 大肠癌和癌旁组织中PGAM1 和mTOR 阳性表达率比较[例（%）]

2.2 PGAM1 和mTOR 阳性表达与大肠癌临床病理特征的关系 PGAM1、mTOR 阳性表达与浸润深度、淋巴结是否转移、TNM 分期均有关（均P＜0.05），而与年龄、性别、肿瘤直径、分化程度均无关（均P ＞0.05），见表2。

表2 PGAM1 和mTOR 表达与大肠癌临床病理特征的关系[例（%）]

2.3 大肠癌组织中PGAM1 和mTOR 表达的相关性 在60 例大肠癌组织中，PGAM1 和mTOR 表达均阳性30例，PGAM1 表达和mTOR 表达均阴性14 例，PGAM1 表达和mTOR 表达呈正相关（r=0.427，P＜0.05），见表3。

3 讨论

酶作用机制的改变是肿瘤细胞代谢的重要生化特征，其将代谢模式从氧化磷酸化切换为放大的糖酵解，并在缺氧条件下促进乳酸的产生。据报道，在24 种不同类型的癌症中存在几种糖酵解酶和葡萄糖转运蛋白的过度表达，这些癌症约占全球所有癌症病例的70%。因此，靶向糖酵解酶可以作为抗癌药物设计的潜在途径。PGAM1 是一种重要的糖酵解酶，可催化3-磷酸甘油酸转化为2-磷酸甘油酸。 研究表明，PGAM1 在几种人类癌症中过度表达，并与肿瘤的生长、存活和侵袭有关[8-9]。Liu 等[10]研究发现，PGAM1 在已发生临床转移的胰腺导管腺癌（PDAC）组织和高度转移性胰腺癌细胞株中过表达。沉默PGAM1 可降低高度转移性胰腺癌细胞的伪足延伸，并使细胞分散性降低；Transwell 实验证实了PGAM1 对胰腺癌细胞系迁移和侵袭的促进作用；并且与弱转移细胞系相比，这种促进作用在高度转移细胞系中更为明显，表明PGAM1 过表达促进PDAC 的侵袭和转移，可作为PDAC 侵袭、转移的潜在治疗靶点。本研究结果显示，大肠癌组织中PGAM1 阳性表达率明显高于癌旁组织，提示PGAM1 过表达可能在大肠黏膜上皮恶变过程中起促进作用。进一步研究发现，PGAM1 阳性表达与大肠癌浸润深度、淋巴结是否转移、TNM 分期均有关，表明PGAM1 阳性表达可能增强大肠癌的浸润深度和淋巴结转移能力，与上述文献报道结果一致。

表3 PGAM1 和mTOR 在大肠癌组织中表达的相关性（例）

mTOR 是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，属于磷脂酰肌醇3 激酶（phosphoinositide3kinase, PI3K）相关的激酶家族[11]。mTOR 是细胞自噬的主要抑制因子，是PI3K/AKT 信号通路的下游靶点[12]。PI3K/Akt/mTOR 信号通路在调控细胞增殖、凋亡、代谢、分化和细胞周期等多种细胞过程中发挥着重要作用[13]。本研究结果显示，与癌旁组织比较，大肠癌组织中mTOR 阳性表达率明显升高，差异有统计学意义，这提示mTOR 阳性表达率升高可能是大肠癌发生的促进因素。进一步分析大肠癌不同临床病理特征与mTOR 阳性表达的关系，结果显示随着大肠癌浸润深度加深、淋巴结发生转移及TNM 分期增加，大肠癌组织mTOR 阳性表达率进一步提高，差异有统计学意义，这表明mTOR 阳性表达与大肠癌浸润、转移密切相关。

本研究中PGAM1 表达和mTOR 表达均阳性者30例，PGAM1 表达和mTOR 表达均阴性者14 例，提示大肠癌组织中PGAM1 和mTOR 表达呈正相关，表明两者在大肠癌发生、发展中可能存在协同调控作用。Ren 等[14]采用RNA 干扰技术敲低肝癌细胞中PGAM1 的表达，抑制糖酵解水平和ATP 生成，进一步激活结节性硬化复合物，降低三磷酸鸟苷结合蛋白的活性，进而抑制下游mTOR 信号通路，引起细胞周期阻滞和细胞自噬等。提示PGAM1 和mTOR 可能通过协同调控作用参与肿瘤的发生、发展过程。

综上所述，大肠癌组织中PGAM1 和mTOR 表达明显升高，这种异常高表达可能与大肠癌的发生、发展密切相关，PGAM1 和mTOR 有望成为大肠癌预后判断及靶向治疗的分子标志物。