宫腔灌注HCG对反复种植失败患者妊娠结局的影响

季晓媛,苏雁,李欣,季慧,凌秀凤,赵纯,张军强,王培

(南京医科大学附属妇产医院/南京市妇幼保健院 生殖医学中心，江苏 南京 210004)

目前体外受精-胚胎移植(invitrofertilization and embryo transfer, IVF- ET)的成功率逐渐提高，但部分患者仍出现反复种植失败(repeated implantation failure，RIF)。RIF较为公认的定义[1]是:经历3次及以上移植周期，且累积移植至少4枚卵裂期优质胚胎或不少于2枚囊胚而未获临床妊娠。胚胎移植后能否获得妊娠的影响因素包括胚胎质量、子宫内膜容受性、母-胎间的相互识别、免疫耐受和血液营养供应等[2]。如何在胚胎质量良好的情况下，通过调节宫腔微环境进而改善子宫内膜容受性，提高胚胎种植率，使不孕症患者获得满意的妊娠结局已经成为生殖医学关注的热点。在影响胚胎种植的众多重要因素中，人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin, HCG)是与其关系最为密切的分子信号[3]。已有研究[4]显示，宫腔灌注HCG共培养自体外周血单个核细胞对原因不明复发性流产患者可显著改善其妊娠结局。在冻融胚胎移植(freeze- thawed embryo transfer，FET)前行HCG宫腔灌注对RIF患者妊娠率是否有类似的影响？本研究对2017年1月至2018年6月于南京医科大学附属妇产医院生殖中心行FET的218例RIF患者的病历资料进行回顾性分析，比较RIF患者在FET前行HCG宫腔灌注对妊娠结局的影响, 旨在为RIF患者助孕方案的选择提供一定的依据。

1 资料与方法

1.1 资料来源

本研究汇总了2017年1月至2018年6月于南京医科大学附属妇产医院生殖中心行FET的218例RIF患者的病历资料。

纳入标准:(1) 既往鲜胚或冻胚移植着床失败≥3次，且累积移植至少4枚优质卵裂胚或2枚优质囊胚；(2) 患者行常规IVF- ET或卵胞浆内单精子显微注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)治疗；(3) 患者无移植困难史；(4) 双方染色体均正常；(5) 接受IVF- ET或ICSI治疗的原因主要包括盆腔输卵管因素、男性因素等。排除标准：(1) 有中、重度宫腔粘连病史；(2) 存在输卵管积水、子宫内膜息肉等占位性病变；(3) 有严重内分泌疾病；(4) 有子宫畸形、子宫肌瘤等器质性病变。

1.2 分组和操作方法

根据移植前是否行宫腔灌注分为观察组(80例)和对照组(138例)。观察组操作方法：将250 μg HCG(艾泽，默克雪兰诺公司)溶于0.5 ml生理盐水，使用前30 min置于37℃恒温箱保存，胚胎移植前30 min抽取40 μl配制好的HCG注射液距宫底2 cm处缓慢注入宫腔。

1.3 胚胎评分

第3天卵裂期胚胎评分按照Peter卵裂期胚胎评分系统[5]评估卵裂期胚胎质量。第5～6天囊胚评分根据Garnder囊胚分级法[6]对形成的囊胚进行分级和评分，并将第5～6天评分≥3 BB的囊胚定为优质囊胚。

1.4 胚胎移植及黄体支持

所有胚胎均采用玻璃化冷冻，复苏后16 h观察，选择存活的胚胎移植，移植后予黄体酮40 mg肌内注射或雪诺同90 mg阴道用药加强黄体支持。

1.5 妊娠结局判断

移植后14 d抽血查β- 人绒毛膜促性腺激素(β- HCG)，若β- HCG>50 mIU·ml-1为阳性。移植28 d后超声检查见孕囊定义为临床妊娠，临床妊娠率=临床妊娠周期数/所有移植周期数×100%。发生在妊娠12周前的妊娠丢失定义为早期流产，早期流产率=早期流产周期数/临床妊娠周期数×100%。一次妊娠宫腔内同时有两个或两个以上胎儿定义为多胎妊娠，多胎妊娠率=多胎妊娠周期数/临床妊娠周期数×100%。胚胎种植率=孕囊数/总移植胚胎数×100%；异位妊娠率=异位妊娠周期数/临床妊娠周期数×100%；活产率=活产的分娩数/所有移植周期数×100%。

1.6 统计学处理

采用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析。正态分布的计量资料用均数±标准差表示，组间比较采用独立样本t检验；非正态分布的计量资料以M(P25,P75)表示，组间比较采用Mann- WhiteyU检验。计数资料以例数(百分比)表示，组间率的比较采用行×列表资料的χ2检验或Fisher确切概率法。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 两组一般情况比较

两组患者的年龄、不孕年限、体质量指数(BMI)、基础性激素[黄体生成激素(LH)、 卵泡生成素(FSH)、雌二醇(E2)]水平、转化日子宫内膜厚度、移植胚胎数目、移植优质胚胎数目、移植优质胚胎率间的差异均无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 两组患者基本情况比较

2.2 两组妊娠结局比较

观察组临床妊娠率(53.750%)、胚胎种植率(31.677%)、活产率(41.250%)均高于对照组(34.783%、21.456%、23.913%)，差异均有统计学意义(均P<0.05)；两组早期流产率(13.953%vs22.917%)、异位妊娠率(2.326%vs6.250%)、多胎妊娠率(18.605%vs16.667%)差异均无统计学意义(均P>0.05)。见表2。

表2 两组患者妊娠结局比较%Tab 2 Comparison of the clinical outcomes of the patients in the two group%

2.3 两组卵裂期胚胎移植患者妊娠结局比较

行卵裂期胚胎移植的RIF患者中观察组临床妊娠率(48.889%vs31.818%)、胚胎种植率(24.510%vs18.440%)、活产率(40.000%vs22.727%)均优于对照组，但各指标差异均无统计学意义(P>0.05)，见表3。

表3 两组卵裂期胚移植患者妊娠结局比较%Tab 3 Comparison of pregnancy outcomes in cleavage embryo transfer group%

2.4 两组囊胚移植患者妊娠结局比较

行囊胚移植的RIF患者中观察组临床妊娠率(60.000%vs37.500%)、胚胎种植率(44.068% vs 25.000%)均优于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；早期流产率(14.286%vs29.630%)、异位妊娠率(0vs3.704%)、多胎妊娠率(23.810%vs11.111%)及活产率(42.857%vs25.000%)差异无统计学意义(P>0.05)。见表4。

表4 两组囊胚移植患者妊娠结局比较%Tab 4 Comparison of pregnancy outcomes in blastocyst transfer group%

3 讨 论

虽然临床上超促排卵方案不断改进、胚胎实验室技术不断提高，但有5%～10%不孕症患者仍然出现RIF[7]。胚胎着床失败的原因复杂，包括胚胎质量、子宫内膜容受性、免疫因素、移植技术及外界环境等，其中子宫内膜容受性是影响妊娠成功的重要因素，决定着胚胎能否植入和继续发育。然而子宫内膜只在短时间内允许胚胎种植，称为子宫的“种植窗”。此时多种体液因子及细胞参与调节，其中HCG起到至关重要的作用[8]。HCG是第一个已知的人类胚胎来源的影响免疫耐受和母胎界面血管生成的信号。研究[9]显示，HCG在胚胎培养基中的浓度与胚胎植入率呈正相关，提示早期胚胎的HCG分泌有益于胚胎种植。子宫腔内灌注HCG与处于种植窗口期的内膜变化显著相关，灌注后可上调胚胎植入相关蛋白，有利于胚胎种植，从而显著提高临床妊娠率[10]。

本研究结果显示，对拟行FET的RIF患者移植前宫腔灌注HCG有利于胚胎着床，提高临床妊娠率，改善RIF患者妊娠结局。针对RIF患者，宫腔灌注操作对子宫内膜起到机械刺激的作用，有利于胚胎着床。黄品秀等[11]使用随机对照单盲方法在FET前宫腔内灌注HCG、集落刺激因子、单核细胞、生理盐水，发现均可明显提高RIF患者的临床妊娠率，说明宫腔灌注的操作起了重要的作用。目前已证实，宫腔灌注治疗能使母胎界面的Th1/Th2细胞因子平衡倾向于Th2，同时还能抑制子宫内膜局部促炎因子的产生、促进抑炎因子的分泌，使抑炎因子占优势，有利于成功妊娠[12]。胚胎着床与HCG介导的免疫反应密切相关。研究[4]显示，HCG直接调节内皮细胞对白细胞介素- 1的反应性，并放大细胞因子介导的对细胞增殖、迁移和血管生成因子释放的影响，而胚胎着床需要母胎界面广泛的血管生成。Diao等[13]认为,HCG发挥调节外周Foxp3+调节性T细胞(Tregs)分化的作用，该循环Tregs的改变可能对有RIF病史的患者妊娠结局产生积极影响。CD4+CD25+Foxp3+Tregs是一类具有免疫应答负调节功能的CD4+T淋巴细胞亚群，对机体维持外周T细胞内环境稳定和免疫耐受状态起着重要作用。宫腔灌注HCG能提高RIF及复发性流产患者种植窗期外周血Tregs百分比，诱导免疫耐受，促进胚胎植入，降低流产率[14]。2019年Liu等[15]的研究结果显示，宫内注射HCG可通过增加Tregs显著改善RIF患者在FET周期中的临床妊娠率、植入率和活产率。

冻融胚胎包括卵裂期胚胎和囊胚，囊胚可以更直观地反映胚胎发育潜能[16]。对RIF患者是在卵裂期胚胎移植还是囊胚移植前行HCG宫腔灌注，哪种方式对改善妊娠结局更有利？这方面目前依然存在争议。在卵裂期冻融胚胎移植之前宫腔内注射500 IU HCG并不明显提高妊娠率[17]。但也有研究结果[18]显示，在卵裂期胚胎移植周期中移植3 d前灌注500 IU HCG是首选的改善妊娠结局的灌注方式。本研究结果显示，相较于卵裂期胚胎移植的RIF患者，行囊胚移植HCG灌注的观察组临床妊娠率、胚胎种植率均优于对照组。因此，RIF患者在囊胚移植时行HCG宫腔灌注较卵裂期胚胎移植时优势可能更明显。近期有学者[15]研究亦表明，接受囊胚移植的RIF患者行HCG灌注治疗后的临床妊娠率、着床率和活产率显著提高，并推测与调节性T细胞密切相关。

综上所述，对于拟行FET的RIF患者，移植前行HCG宫腔灌注有利于胚胎着床，提高临床妊娠率，对改善RIF患者妊娠结局有一定积极意义。同时发现，在囊胚移植时宫腔灌注HCG较卵裂期胚胎移植时灌注可能存在更明显的优势。但本研究样本量较少，下一步将扩大样本量，并对其机制进行更深入的研究。