血清外泌体miRNA- 223在宫颈癌诊断及预后评价中的价值研究

2021-04-08 07:57蒋露周静唐姣
东南大学学报(医学版) 2021年1期
关键词:外泌体试剂盒宫颈癌

蒋露,周静,唐姣

(湖南省妇幼保健院 妇产科,湖南 长沙 410008)

宫颈癌是世界第三大常见的女性癌症,每年新增56.9万例,其中265 700例死亡[1]。近年来,宫颈癌的发病呈年轻化趋势,并且发病率逐渐升高,严重威胁到患者的心身健康[2]。早期诊治对提高宫颈癌患者的生存时间及生命质量有重要意义。微小RNA(microRNA,miRNA)是长度为18~25 nt的非编码RNA,参与基因转录后的调控。既往研究[3- 4]已证实,miRNA广泛参与了细胞的增殖、分化、凋亡等生物学过程,在肿瘤的发生和发展中起到重要作用。miRNA- 223与宫颈癌在内的多种癌症进展有关[5- 8]。外泌体是活细胞分泌的纳米级囊泡小体,内含丰富的蛋白质、miRNA和lncRNA等,可以在细胞间转运,从而调节细胞的生物学功能[9]。本研究检测了宫颈癌患者血清外泌体miRNA- 223的表达水平,旨在探讨miRNA- 223在宫颈癌早期诊断及预后评价中的价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2010年1月至2014年1月本院收治的168例宫颈癌患者为研究对象(宫颈癌组),均经过组织病理学检查确诊。行根治性子宫切除术和盆腔淋巴结切除术治疗,所有患者术前均未接受过放化疗。术前采集外周血5 ml,分离血清,用于提取外泌体miRNA- 223。另选取同期在本院进行健康体检的160例正常者为对照(对照组),于体检当日采血。本实验经本院伦理委员会批准,所有受试者均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 血清外泌体的分离及鉴定 取宫颈癌患者血清1 ml,在4 ℃下以2 000 r·min-1离心15 min,取上清液。加入外泌体分离试剂(美国Sigam公司),于4 ℃下静置15 min,以15 000 r·min-1离心2 min,弃去上清液,所留沉淀物即为外泌体,以50 μl的磷酸盐缓冲液进行重悬,分装后用于后续实验。

取10 μl外泌体加于铜网上沉淀1 min,用滤纸吸尽浮液。滴加10 μl浓度为2%的醋酸双氧铀(上海鼓臣生物技术有限公司)于铜网上沉淀1 min,用滤纸吸尽浮液。常温下干燥10 min,用Tecnai G2 Spirit 120 kV透射电子显微镜观察外泌体形态。

用Western blotting法检测外泌体标志物TSG101和CD63的表达[10]。在外泌体中加入RIPA细胞裂解液(北京蓝博斯特生物技术有限公司),提取蛋白。用BCA试剂盒(上海一研生物科技有限公司)进行蛋白定量检测,随后进行SDS- PAGE凝胶电泳,将分离的蛋白电转至PVDF膜上。用5%脱脂牛奶封闭,加入抗CD63小鼠单克隆抗体(1∶200,美国Invitrogen公司)或抗TSG101兔单克隆抗体(1∶10 000,美国Sigma公司),4 ℃摇床过夜。TBST洗涤3次后加入山羊抗兔IgG- HRP(1∶10 000,美国ABCAM)或兔抗鼠IgG- HRP(1∶10 000,美国ABCAM)。最后用ECL显影。

1.2.2 RT- PCR检测血清外泌体miRNA- 223的表达量 用miRNAOUT试剂盒(美国Sigam公司)提取miRNA,随后进行miRNA逆转录。本研究的引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司设计并提供。miRNA- 223上游引物为5′- CTGAGTTGGACACTCCATGTGGTAGAGTGTCA- 3′,下游引物为5′- ATCCAGTACAGGGTCCGAGG- 3′。内参U6 snRNA上游引物为5′- CTCGCTTCGGCAGCACATATACT- 3′,下游引物为5′- ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC- 3′。用RT- PCR试剂盒(美国Sima公司)检测miRNA相对表达量,检测步骤严格按照试剂盒说明书进行。用2-ΔΔCT公式计算miRNA- 223的表达量。以miRNA- 223表达的中位数为截断值,将宫颈癌患者分为高表达组和低表达组。

1.2.3 病例资料采集 回顾性分析所有宫颈癌患者的临床资料,包括年龄、肿瘤大小、组织学分级、组织学类型、FIGO分期、淋巴结转移、宫颈浸润深度。

1.2.4 随访 采用电话及门诊对所有宫颈癌患者进行随访。术后半年内,每3个月随访1次;此后,每半年随访1次。总生存期(overall survival,OS)定义为术后第1天至死亡或最后1次随访。无病生存期(disease- free survival,DFS)定义为术后开始至癌症复发或由于疾病进展导致患者死亡的时间[11]。

1.3 统计学处理

采用SPSS 19.0统计软件进行统计学分析。计数资料采用例表示,组间比较用χ2检验;用受试者工作特征(ROC)曲线分析miRNA- 223诊断宫颈癌的价值,计算曲线下面积(AUC)、灵敏度和特异度;用Kaplan- Meier法绘制生存曲线,生存率比较采用Log- Rank检验;多因素分析采用Cox比例风险模型。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 血清外泌体鉴定

电镜下可见外泌体呈圆形囊泡状,直径50~150 nm(图1)。Western blotting检测到外泌体表面标志物CD63和TSG101的表达(图2)。宫颈癌组和对照组73%的外泌体囊泡直径为50~150 nm,27%的直径<50 nm。

图1 电镜下外泌体(×50 000)

图2 Western blotting检测外泌体标志物CD63和TSG101

2.2 两组血清外泌体miRNA- 223的表达水平

宫颈癌组血清外泌体miRNA- 223的相对表达量为2.26±0.68,明显高于对照组的0.89±0.21,差异有统计学意义(t=23.199,P<0.001)。

2.3 血清外泌体miRNA- 223诊断宫颈癌的临床价值分析

用ROC曲线分析血清外泌体miRNA- 223诊断宫颈癌的价值,AUC为0.928(95%CI:0.867~0.976),最佳截断值为1.21。miRNA- 223表达量为1.21时,诊断宫颈癌的灵敏度和特异度分别为86.55%和94.37%(图3)。

图3 血清外泌体miRNA- 223诊断宫颈癌的ROC曲线

2.4 血清外泌体miRNA- 223表达水平与宫颈癌临床特征的关系

血清外泌体miRNA- 223表达水平与FIGO分期、淋巴结转移和宫颈浸润深度有关(P<0.05),与年龄、肿瘤大小、组织学分级和组织学类型无关(P>0.05),见表1。

2.5 血清外泌体miRNA- 223表达水平与宫颈癌患者预后的关系

168例宫颈癌患者中位随访时间为21个月(3~60个月)。Kaplan- Meier分析结果显示,高表达组患者OS和DFS均低于低表达组(P<0.001),见图4、5。Cox多因素分析结果显示,FIGO分期Ⅱb~Ⅲa、淋巴结转移、宫颈浸润深度≥2/3、miRNA- 223高表达是宫颈癌患者OS和DFS的独立影响因素(P<0.05),见表2、3。

3 讨 论

宫颈癌的发病率和死亡率均较高,特别是在发展中国家。我国2012年宫颈癌新发病例61 691例,预计2030年达到93 500例[12]。早期诊断宫颈癌是临床上亟须解决的问题。近年来,越来越多的肿瘤标志物被用于辅助诊断宫颈癌并评价患者的预后情况。非编码RNA是近年来肿瘤领域研究的热点。miRNA长度为18~25 nt,参与基因转录后的调控,在肿瘤的发生和发展中起到重要作用。外泌体中的miRNA具有肿瘤特异性,在不同贮存条件下都较为稳定[13]。本研究从血清中分离出外泌体显示,宫颈癌患者外泌体中miRNA- 223表达水平明显升高。

miRNA- 223位于X染色体q12上,在多种肿瘤中异常表达。miRNA- 223在不同肿瘤中发挥的效应也不同。在膀胱癌的研究中,Guo等[7]发现,miRNA- 223在癌组织中的表达明显上调,其可能通过靶向核受体辅活化子1发挥抑癌作用。Yang等[14]也发现,乳腺癌细胞(T47D、MCF- 7、SKB- R3、MDA- MB- 231、MDA- MB- 435)和乳腺组织中miRNA- 223表达下调,其通过靶向基质相互作用分子1抑制癌细胞的增殖和侵袭。但Kurashige等[15]发现,食管癌组织中miRNA- 223表达水平明显高于癌旁组织,miRNA- 223可通过调控含F- 框WD重复域蛋白7发挥促癌作用,其高水平表达与食管鳞癌患者生存预后差有关。本研究同样发现,宫颈癌患者血清外泌体miRNA- 223呈高水平表达,并且与患者不良预后有关。Gao等[4]通过生物信息学方法分析得出,宫颈癌组织中miRNA- 223表达水平上调。

表1 血清外泌体miRNA- 223表达水平与宫颈癌临床特征的关系例

图4 宫颈癌患者的总体生存率分析

图5 宫颈癌患者的无病生存率分析

表2 Cox单因素和多因素分析影响宫颈癌患者OS的因素

表3 Cox单因素和多因素分析影响宫颈癌患者DFS的因素

在体外研究中,Wu等[8]发现,宫颈癌HeLa细胞的miRNA- 223表达上调,其可能通过FOXO1基因促进癌细胞增殖。上述研究提示,miRNA- 223在宫颈癌中发挥促癌作用。

本研究采用ROC曲线法分析了血清外泌体miRNA- 223诊断宫颈癌的临床价值,结果显示miRNA- 223诊断宫颈癌的灵敏度和特异度分别为86.55%和94.37%。血清外泌体miRNA在癌症中的诊断价值既往已有报道。尽管如此,未来还需要开发出外泌体miRNA快速检测试剂盒,才能适用于临床上癌症的早期筛查和诊断。本研究结果显示,FIGO分期、淋巴结转移、宫颈浸润深度与宫颈癌患者的OS及DFS有关,这与既往报道[16- 17]一致。血清外泌体miRNA- 223高表达是宫颈癌患者OS和DFS的独立影响因素,这是因为miRNA- 223参与了宫颈癌细胞的增殖和侵袭,进而影响到患者的预后。

本研究的局限性为:(1) 本研究的样本量相对较小,因此对结果的解释需要谨慎。(2) 本研究仅检测了miRNA- 223表达水平的变化,未分析下游靶分子的变化。因此,未来需要开展细胞及动物研究,以进一步明确miRNA- 223的生物学意义。(3) 本研究未检测宫颈息肉、子宫内膜异位症、宫颈管肌瘤和宫颈乳头瘤等良性病变患者血清外泌体miRNA- 223的表达水平,miRNA- 223对于宫颈癌鉴别诊断的意义需要未来进一步研究。

综上所述,宫颈癌患者血清外泌体miRNA- 223的表达水平明显高于健康人,miRNA- 223对宫颈癌的早期诊断及预后判断有一定价值。

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