沉默JMJD2B通过诱导DNA损伤抑制人胃癌细胞的恶性表型

陈丽莎，徐永成，曾书君，陈惠新

(中山大学附属惠州市中心人民医院 消化内科，广东 惠州 516000)

近年来涌现了大量的关于表观遗传修饰、DNA损伤反应、肿瘤发生发展三者之间关系的研究，其中包括是否可通过调节组蛋白甲基化修饰状态改变肿瘤细胞对DNA损伤的反应，从而降低肿瘤的耐药性。磷酸化H2AX(serine 139，γH2AX)是反映DNA损伤的重要指标，为细胞发生最严重的DNA损伤—DNA双链断裂(DNA double- strand break, DSB)的标志[1]。对结肠癌的研究[2]显示，含Jumonji结构域的蛋白2B(Jumonji domain- containing protein 2B, JMJD2B)可通过STAT3信号通路调节DNA损伤反应，但JMJD2B在胃癌中是否也可通过调节DNA损伤反应影响肿瘤的发生发展，尚无相关研究。

1 材料与方法

1.1 材料

人胃癌细胞株MGC803、SGC7901来自惠州市中心人民医院消化实验室。胎牛血清及RPMI- 1640培养基购自美国Gibco公司。JMJD2B siRNA、阴性对照siRNA(与任何靶基因无序列同源性)购自上海吉玛公司。一抗：兔抗JMJD2B单克隆抗体(美国Bethyl Laboratories公司)、兔抗phorsphor- H2AX(Ser 139)多克隆抗体(美国Millipore公司)、兔抗α- tubulin抗体(内参照，美国Cell Signaling Technology公司)；二抗：山羊抗兔 HRP(上海康成公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 对MGC803、SGC7901细胞使用含10%胎牛血清的RPMI- 1640培养基培养，并置于恒温37 ℃、体积分数5% CO2的培养箱，95%湿度条件下进行培养。

1.2.2 siRNA转染 取对数生长期细胞种植于6孔板中，按细胞2×105孔-1进行接种，24 h后待细胞生长至密度约50%时，将JMJD2B siRNA或阴性对照siRNA使用转染试剂Lipofectamine 2000(美国Invitrogen公司)转染，48 h后收集细胞或进行后续实验。

1.2.3 彗星实验 采用0.25%胰蛋白酶消化对数生长期细胞，以1 000 r·min-1离心10 min，PBS调整细胞浓度为5×104ml-1。使用彗星实验试剂盒(Comet assay,北京博乐通生物科技有限公司)，取100 μl 0.5%正常熔点琼脂糖铺于磨砂载玻片上，盖上盖玻片，置于冰上固化5～10 min；移去盖玻片，在第一层胶上铺上100 μl 0.5%低熔点琼脂糖与10 μl细胞悬液(约500个细胞)的混合液，盖上盖玻片，置于冰上固化5～10 min；移去盖玻片，细胞裂解2.5 h，电泳缓冲液中放置20 min使DNA解链，电泳25 min，中和，DAPI 染色，荧光显微镜下观察结果。

1.2.4 Western blotting 细胞转染JMJD2B siRNA或阴性对照siRNA 48 h后，以0.25%胰蛋白酶消化收集，离心抽提蛋白，BCA蛋白定量试剂盒(美国Thermo Fisher Scientific公司)进行蛋白定量。取50 μg蛋白，进行SDS- PAGE电泳分离，稳压冰浴电转至NC膜，5%脱脂奶粉常温封闭1 h，一抗4 ℃孵育过夜、二抗孵育1 h，常规ECL曝光，扫描蛋白条带，进行灰度分析。

1.2.5 Cell Counting Kit- 8(CCK- 8)实验 于96孔板中按5×103孔-1接种对数生长期的MGC803、SGC7901细胞，每孔200 μl，24 h 后待细胞生长至密度约50%时转染siRNA，分别于48、72 h后收集细胞进行CCK- 8实验。设不含细胞、只含培养基的空白组、阴性对照siRNA组和JMJD2B siRNA组，每组设3个复孔。按照CCK- 8试剂盒(日本同仁化学研究所)说明书操作，以酶标仪读取各孔450 nm波长处吸光度值(A值)。

1.2.6 细胞周期分析 培养MGC803、SGC7901细胞24 h至对数生长期，按阴性对照组、实验组分别转染siRNA 48 h，每组设3个复孔。用0.25%胰蛋白酶消化、收集细胞，预冷体积分数70%乙醇4 ℃固定过夜，PBS洗涤，加入100 U·ml-1RNA酶A(D202，TaKaRa公司)1 ml，37 ℃水浴30 min，加入含Triton X- 100(上海碧云天生物技术有限公司)的50 g·ml-1碘化丙啶染液(propidium iodide，PI，上海碧云天生物技术有限公司)0.5 ml，4 ℃避光30 min，进行流式细胞仪检测。

1.2.7 细胞凋亡分析 培养MGC803、SGC7901细胞24 h至对数生长期，按阴性对照组、实验组分别转染siRNA 48 h，每组设3个复孔。按照Annexin V Apoptosis Detection Kit I(美国BD Pharmingen公司)说明书操作，进行流式细胞仪检测。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 沉默人胃癌细胞JMJD2B的表达诱导细胞发生DNA损伤反应

人胃癌细胞株MGC803、SGC7901于相同条件下培养，并分别给予阴性对照siRNA、JMJD2B siRNA的处理，采用Western blotting检测DNA损伤特异性标志物γH2AX的表达，同时应用彗星实验检测DNA损伤情况，结果均显示沉默JMJD2B表达的人胃癌细胞发生DNA损伤(图1)。

图1 沉默人胃癌细胞JMJD2B的表达诱导细胞发生DNA损伤反应

2.2 沉默人胃癌细胞JMJD2B的表达对增殖的影响

对转染JMJD2B siRNA的MGC803、SGC7901细胞行CCK- 8实验的结果显示，实验组相对存活率低于阴性对照组(图2)，说明沉默JMJD2B表达的人胃癌细胞的增殖明显受到抑制。

图2 沉默人胃癌细胞JMJD2B的表达对细胞增殖的影响

2.3 沉默人胃癌细胞JMJD2B的表达对细胞周期分布的影响

对转染JMJD2B siRNA的MGC803、SGC7901细胞分别行流式细胞仪分析的结果显示，MGC803细胞发生G0/G1期细胞周期阻滞，而SGC7901细胞发生G2/M期细胞周期阻滞(图3)，说明沉默JMJD2B表达诱导了细胞周期阻滞的发生，从而抑制细胞的增殖。

图3 沉默人胃癌细胞JMJD2B的表达对细胞周期的影响

2.4 沉默人胃癌细胞JMJD2B的表达对凋亡的影响

对转染JMJD2B siRNA的MGC803、SGC7901细胞行流式细胞仪分析的结果显示，凋亡细胞比例明显上升(图4)，说明沉默JMJD2B的表达诱导了细胞发生凋亡，从而抑制细胞的增殖。

图4 沉默人胃癌细胞JMJD2B的表达对细胞凋亡的影响

3 讨 论

组蛋白甲基化修饰以及DNA损伤反应在肿瘤发生发展中的作用早有研究，近年来关于两者之间的相互关系在肿瘤中的研究[3- 4]越来越多。本研究结果显示，沉默人胃癌细胞组蛋白去甲基化酶JMJD2B的表达可诱导DNA损伤反应的发生(图1)。在肿瘤早期，人体细胞通过诱导DNA损伤反应来抑制肿瘤的发生发展，而DNA损伤反应则通过激活信号通路来维持基因组的稳定性，其中包括：(1) 由DNA损伤修复蛋白介导细胞进行DNA损伤修复，细胞发生周期阻滞；(2) 更严重的DNA损伤会进入p53介导的细胞凋亡途径[5]。人胃癌细胞发生DNA损伤反应后，导致细胞周期阻滞、细胞凋亡的细胞比例增加(图3、4)。然而，在肿瘤细胞中改变组蛋白甲基化修饰状态诱导DNA损伤的具体机制尚未阐明。

组蛋白甲基化修饰在DNA损伤反应的很多环节发挥重要作用，包括解开高度有序的染色质结构、启动细胞信号级联反应、募集蛋白质至DSB位点以及促进DNA断裂修复过程等。细胞发生DSB时，组蛋白翻译后修饰在诱导及调节细胞对损伤的反应中至关重要。沉默组蛋白甲基转移酶EZH2的表达可激活细胞发生DNA损伤反应[6]，组蛋白甲基转移酶SET7和去甲基化酶LSD1均可通过调节UHRF1的甲基化水平在DSB修复中发挥重要作用[7]。H3K9me3去甲基化酶JMJD2D和JMJD2A通过下调H3K9me3的甲基化水平，抑制了Tip60激活ATM介导的DNA损伤反应，磷酸化ATM下调，其介导的p53和chk2磷酸化受抑制，DNA损伤反应异常，诱导细胞发生转化甚至癌变。抑制组蛋白去甲基化酶PHF2的表达可上调DNA复制相关基因启动子上H3K9me3的水平，诱导细胞发生DNA损伤[8- 9]。抑制JMJD2B可诱导DNA损伤反应介导的p21和PIG3的表达，同样，细胞发生DNA损伤后，JMJD2B作为p53的靶基因在调节DNA损伤反应中亦发挥重要作用[10]。

然而，组蛋白甲基化在DNA损伤反应及修复过程发挥作用的机制尚不十分清晰。细胞在受到电离辐射后会发生DNA损伤，通过抑制组蛋白去甲基化酶KDM2B的活性，组蛋白H3赖氨酸36二甲基化水平增加，DSB位点上含Ku70的DNA- PK募集增加，DNA损伤修复途径NHEJ被激活，发生放疗抵抗，细胞存活率提高[11]。接受电离辐射的细胞通过抑制JMJD2B或甲基转移酶SUV39H1的表达可延缓结构性异染色质DNA修复的进程，进而降低细胞存活率[12]。临床上，脑胶质瘤易复发，同时放化疗抵抗率高，而使用H3K9甲基转移酶G9a特异性抑制剂BIX- 01294可提高胶质瘤细胞的放疗敏感性，其机制包括抑制DSB的修复[13]，促进肿瘤细胞死亡。目前使用的很多化疗药属于DNA损伤药物。Mar等[14]报道，组蛋白甲基转移酶SETD2突变可通过影响细胞对DNA损伤的识别，诱导细胞对DNA损伤药物的耐药性。组蛋白甲基转移酶MMSET调节H4K20甲基化水平，有利于53BP1募集至DSB位点[15]；同样，抑制H3K79甲基转移酶DOT1L的表达，也抑制了53BP1募集至DSBs位点[16- 17]，细胞发生DNA损伤，利用该特点在结直肠癌细胞中使用siRNA或小分子抑制剂抑制DOT1L的表达可通过调节DNA损伤修复途径，提高肿瘤细胞对化疗药的敏感性[18]。

JMJD2B是抗肿瘤药物作用的重要靶点[19]。在耐顺铂的人非小细胞肺癌[20]细胞中，JMJD2家族，特别是JMJD2B的表达明显上调，而使用JMJD2家族蛋白的特异性抑制剂可增加癌细胞对顺铂的反应[21]。本研究结果显示，抑制JMJD2B可诱导人胃癌细胞发生DNA损伤，抑制癌细胞的恶性表型。因此，进一步深入研究JMJD2B与DNA损伤反应之间的关系和机制，有望可减少肿瘤的放化疗抵抗性。