肝细胞癌组织中基质金属蛋白酶14的表达及其与预后的关系

杨涛，苏忠，杨奕，刘剑，李高岩

(秦皇岛市第一医院 普外科，河北 秦皇岛 066000)

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是常见的消化道肿瘤之一，其发病机制尚未完全明确，严重影响人的生命健康并给家庭及社会带来沉重的负担。HCC具有易侵袭、易转移的特点，虽然近年来肝癌的诊疗技术有了飞速发展，但是HCC患者5年生存率仍未见明显提高[1]。寻找HCC新型分子生物学标志物是基础及临床研究的重点。既往研究发现，细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的蛋白水解是肿瘤浸润和转移的关键步骤，而基质金属蛋白酶14(matrix metalloprotease 14，MMP14)被证实在此过程中发挥重要作用[2]。MMP14也被称为膜型1 MMP(MT1- MMP)，是MMP家族新成员，能够参与细胞基底膜和ECM的降解，促进肿瘤细胞的侵袭和转移[3]。MMP14通过上皮间质转化参与HCC的侵袭和远处转移[4]。本研究旨在探讨HCC组织中MMP14的表达水平及其与患者预后的关系。

1 材料与方法

1.1 样本来源

选取2008年6月至2013年5月本院手术切除的248例HCC癌组织标本及其配对的癌旁组织标本(距离癌组织边缘≥5 cm)。纳入标准：(1) 术前未接受放疗、化疗或免疫治疗；(2) 术后病理学检查确诊为HCC；(3) 病历资料完整。排除标准：(1) 合并其他部位肿瘤；(2) 随访资料不全。其中男173例，女75例；年龄43～71岁，平均(53.78±16.09)岁；HBsAg阳性179例；有肝门淋巴结转移140例；低分化139例，中高分化109例；TNM分期为Ⅰ～Ⅱ期111例，Ⅲ～Ⅳ期137例。将术中切取的组织分成两部分:一部分冻存于-70 ℃冰箱，用于Western blotting检测；另一部分用福尔马林固定并用石蜡包埋，用于免疫组织化学染色。

1.2 Western blotting检测组织中MMP14的表达水平

随机选取6例HCC癌组织及其配对的癌旁组织进行检测。取组织100 g，冰上充分研碎后加入蛋白裂解液(武汉博士德生物工程有限公司)，以12 000 r·min-1离心15 min，收集上清液。用BCA试剂盒(美国Pierce公司)检测蛋白浓度，随后进行10% SDS- PAGE凝胶电泳，将蛋白转移至PVDF膜上。用脱脂奶粉封闭1 h，孵育一抗(MMP14单克隆抗体，稀释500倍，美国Sigma公司)，4 ℃过夜后弃去一抗。温室孵育二抗(羊抗兔IgG，稀释2 000倍，美国Sigma公司)，2 h后弃去二抗。以GAPDH作为内参，用ECL发光仪成像，最后采用Image J软件分析灰度值，计算蛋白相对表达量。

1.3 免疫组织化学染色法检测组织中MMP14表达水平

石蜡切片由本院病理科制备，切片厚度为4 μm。检测所有HCC癌组织及癌旁组织中MMP14的表达水平。检测时常规脱蜡至水，随后放入预热的柠檬酸缓冲液中，高压处理2 min，冷却至室温。滴加3%过氧化氢溶液除去内源性过氧化物酶，温室孵育10 min。滴加MMP14单克隆抗体(稀释500倍)，4 ℃过夜。滴加生物素标记的羊抗兔IgG。最后用DAB显色，苏木紫复染，常规脱水、透明、干燥、封片。在显微镜下观察细胞染色强度和阳性细胞比例。染色强度：阴性为0分；浅黄色为1分；棕黄色为2分；棕褐色为3分。阳性细胞比例：0%～10%为1分；11%～50%为2分；51%～80%为3分；81%～100%为4分。将以上两个评分相乘，0分为MMP14阴性表达；1～3分为弱阳性表达；4～8分为中等阳性表达；9～12分为强阳性表达。0～3分为MMP14低表达；4～12分为MMP14高表达。

1.4 随访

术后对所有患者进行门诊及电话随访。前2年每3个月随访1次；第3年后每半年随访1次。随访时进行血清甲胎蛋白、腹部B超、CT或MRI检查。随访截至2019年7月。

1.5 统计学处理

应用SPSS 20.0统计软件进行分析。计量资料以均值±标准差表示，两组间比较用t检验；计数资料的比较用卡方检验。生存分析用Kaplan- Meier法，建立Cox比例风险回归模型分析影响HCC的因素。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 Western blotting检测组织中MMP14的表达

HCC癌组织中MMP14蛋白相对表达量为0.91±0.08，明显高于癌旁组织的0.24±0.08(P<0.05)，见图1。

1.癌组织；2.癌旁组织

2.2 免疫组织化学染色法检测组织中MMP14

MMP14主要定位于细胞质中，在癌组织中高表达，在癌旁组织中呈阴性或弱阳性表达(图2)。癌组织中MMP14表达率为62.10%(154/248)，明显高于癌旁组织的26.61%(66/248)，差异有统计学意义(χ2=63.258,P<0.001)。

A.癌旁组织；B.癌组织

2.3 癌组织中MMP14表达与HCC临床病理特征的关系

MMP14与HCC分化程度及TNM分期有关(P<0.05)，与性别、年龄、HBsAg、甲胎蛋白水平、肿瘤大小、肿瘤数量和肝门淋巴结转移无关(P>0.05)，见表1。

2.4 影响HCC患者预后的单因素和多因素分析

以患者是否存活或是否无瘤存活作为因变量，性别、年龄、肿瘤大小、甲胎蛋白水平、HBsAg、肿瘤数量、肝门淋巴结转移、分化程度、临床分期和MMP14表达水平为自变量，进行Cox多因素分析。结果显示，肿瘤低分化、高TNM分期和MMP14高表达是HCC患者总生存期和无瘤生存期的独立影响因素(P<0.05)，见表2、3。

2.5 MMP14与HCC患者生存预后的关系

MMP14高表达患者的总体生存时间和无瘤生存时间明显短于低表达患者(P值分别为0.008和0.004，Log- Rank检验)，见图3。

3 讨 论

肝癌是消化系统最常见的恶性肿瘤，死亡率较高，其发病与遗传、环境、病毒感染、体质等有关。肝癌患者预后较差的原因是复发和转移，而MMP又与两者密切相关。因此，探讨MMP与肝癌临床病理特征及预后的关系有重要意义。MMP是一组锌依赖性内肽酶，除可以降解细胞外基质外，还可以作用于蛋白激酶、生长因子、细胞表面分子和细胞趋化因子等[5]。MMP在生理状态及癌症进展时细胞外基质重塑过程中起重要作用[6]。MMP14也被称为MT1- MMP，是MMP家族新成员，被认为是MMP家族中与肿瘤浸润和转移最为相关的酶[7]。MMP14与宫颈癌[8]、胃癌[9]、结直肠癌[10]、肺癌[11]等的发生及发展有关。本研究结果显示，HCC癌组织中MMP14蛋白表达水平明显高于癌旁组织，并且其表达水平与HCC分化程度、TNM分期有关，提示MMP14可能参与了HCC的发生和进展。

表1 MMP14与HCC临床病理特征的关系例

肿瘤的进展与肿瘤细胞的增殖、侵袭及转移有关。MMP14参与肿瘤进展的机制[12- 15]可能为：(1) 降解Ⅰ～Ⅲ型胶原、纤维粘连蛋白、蛋白多糖和纤维素等细胞外基质；(2) 激活MMP2、MMP13，使蛋白水解效应放大；(3) 通过与细胞黏附分子作用，影响细胞在细胞外基质上的迁移；(4) 上调血管生成因子表达，促进血管形成，进而促进肿瘤浸润和转移；(5) 促进上皮间质转化，进而影响肿瘤细胞的侵袭和迁移。

影响HCC预后的因素较多。本研究发现，肿瘤低分化、高TNM分期是HCC患者总生存期和无瘤生存期较短的独立影响因素。这与既往报道[16- 18]一致。增殖和侵袭是影响癌症患者生存预后的重要因素，而MMP14又参与了此过程，因此MMP14可能有助于预测HCC的预后。MMP14与结直肠癌[10]、膀胱癌[19]、胃癌[9]及乳腺癌[20]等的生存预后有关。本研究同样发现，高MMP14表达的HCC患者的生存预后较差，并且MMP14是影响HCC患者总生存期和无瘤生存期的独立因素。

在治疗方面，MMP14与乳腺癌放疗及化疗的敏感性有关[21]。Ager等[22]也发现，阻断MMP14可降低免疫抑制性转化生长因子β，抑制小鼠乳腺癌肿瘤生长，并且对放疗的反应性增强。因此，可以推测，MMP14可能与HCC的放化疗敏感性有关，但是本研究并未对此进行分析，需要未来进一步探讨。

表2 HCC患者总生存期的单因素和Cox多因素分析

表3 HCC患者无瘤生存期的单因素和Cox多因素分析

图3 MMP14与HCC患者总生存期及无瘤生存期的关系(Kaplan- Meier生存曲线)

综上所述，HCC癌组织中MMP14表达水平明显高于癌旁组织。MMP14表达水平与HCC分化程度及TNM分期有关。MMP14是HCC预后的独立影响因素，其表达水平越高，患者总生存期和无瘤生存期越短。本研究也存在一些局限性:未检测患者血清中MMP14的表达水平，MMP14早期诊断及鉴别诊断HCC的价值须进一步分析；未探讨MMP14在HCC中的作用机制，需要今后深入分析。