离子交换色谱法测定牛初乳中乳铁蛋白的质量浓度

刘佳欣，贺梦瑶，汤兴楠，栾凯雯

分析检测

离子交换色谱法测定牛初乳中乳铁蛋白的质量浓度

刘佳欣，贺梦瑶，汤兴楠，栾凯雯

（沈阳化工大学 制药与生物工程学院，辽宁 沈阳 110142）

建立一种离子交换色谱法测定牛初乳中乳铁蛋白质量浓度的方法。采用cm-sepharose fast flow预装柱5 mL，配置质量浓度为10、20、30、40、50、60、70、80μg·mL-1的标准乳铁蛋白溶进行液色谱分离，pH值为7.0，浓度为0.02 mol·L-1的磷酸盐溶液为起始缓冲液，进样量为1 mL，流速1 mL·min-1，浓度为1 mol·L-1NaCl溶液洗脱，检测波长475 nm。回归方程：=1.277 4+16.727 0，2=0.999，线性范围为10~80 μg·mL-1，平均加标回收率为96.56%。此方法在分离牛初乳中的乳铁蛋白同时，又可以测定乳铁蛋白的含量，方便，快捷，结果准确可靠，重现性好。

离子交换；牛初乳；乳铁蛋白；检测

乳铁蛋白（Lactoferrin，LF）是一种相对分子量约为80 kDa的铁结合性糖蛋白，主要存于哺乳动物的乳汁中[1]，经研究发现也出现在人和哺乳动物的胰液、胆汁和小肠分泌液等组织[2]。乳铁蛋白在乳中的含量最为丰富，特别是在初乳中含量较高，人初乳中乳铁蛋白的浓度可达到7 mg·mL-1，牛初乳中乳铁蛋白的浓度平均为1 mg·mL-1 [3]。乳铁蛋白具有多种生物学功能,可以促进铁的吸收[4]，抗癌，抗病毒,抗氧化，调节机体免疫反应[5-6]。乳铁蛋白还具有抑制脂质过氧化、抑制胆固醇的积累，促进骨骼生长的功能[8-9],还可以同多种抗生素和抗病毒药物协同作用[10-11]。

目前检测乳铁蛋白的方法有很多种，如高效液相色谱法[12]，酶联免疫法[13]，聚丙烯酰胺凝胶电泳法[14]，毛细管电泳法[15]等。高效液相色谱法的优点是快速，准确，稳定可靠，精密度高，但该方法对样品的纯度要求比较严格，仅适用于高纯度的样品测定[16]。酶联免疫法的基本原理是抗原抗体的特异性反应，样品中的其他蛋白质并不与乳铁蛋白的抗体发生反应，因此该法对样品纯度要求较低，不需要进行纯化，但是该方法操作时需要对待测样品进行逐级稀释，过程繁琐，容易出现误差[17]。毛细管电泳法具有分析速度快、分离效率高、操作简便、操作成本低等优点，但该方法仅适用于保健食品、婴幼儿配方奶粉中乳铁蛋白的测定，对生乳中乳铁蛋白含量的测定效果不佳[18]。聚丙烯酰胺凝胶电泳法具有设备简单、费用低、操作方法简单等优点，但检测时间长、不宜检测大批量样品、检测过程较为复杂等[19]。本试验试验采用离子交换色谱法测定牛初乳中乳铁蛋白含量，操作方便，准确可靠，并且分离和检测可以同时进行，大大提高试验效率。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

95%乳铁蛋白，biotopped公司；牛初乳，木兰花乳业奶牛养殖场； cm-sepharose fast flow 5 mL，通用电气公司；盐酸，磷酸二氢钠，磷酸氢二钠均为分析纯，西陇化工股份有限公司。

1.2 仪器与设备

AKTA purifier，通用电气公司；高速冷冻离心机，赛默飞世尔科技有限公司；Synergy2多功能酶标仪，美国伯腾仪器有限公司；HH4型数显恒温水浴锅, 金坛市天瑞仪器有限公司；GB1302 型电子精密天平，梅特勒托利多仪器公司，SHZ-D (Ⅲ)循环水式真空泵，巩义市予华仪器责任公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品预处理

将牛初乳装入100 mL离心管中，以10 000 r·min-14 ℃离心30 min，除去上层脂肪；加入1 mol·L-1的稀盐酸，缓慢添加调至牛初乳溶液pH为4.6，水浴加热40 ℃，保温30 min，然后放入高速冷冻离心机中，以10 000 r·min-140 ℃离心30 min，保留上层乳清蛋白，将得到乳清蛋白溶液；进行抽滤，得到的粗样品，用0.45μm的微孔滤膜过滤，得到纯净的样品。

1.3.2 标准乳铁蛋白溶液的配置

精确称取纯度为95%的乳铁蛋白标准品0.01 g，用0.15 mol·L-1NaCl溶液定容至100 mL，配成质量浓度为100 μg·mL-1标准乳铁蛋白溶液。选用0.22 μm的微孔滤膜过滤，用于色谱测定。

1.3.3 最大吸收波长的确定

将上述配置好的100 μg·mL-1标准乳铁蛋白溶液，用紫外分光光度计在400~700 nm下扫描，测定最大吸收波长为475 nm。

1.3.4 色谱条件

色谱柱cm-sepharose fast flow 预装柱5 mL；流动相：A溶液（pH值为7.0浓度为0.02 mol·L-1的磷酸缓冲盐溶液）；B溶液（pH值为7.0浓度为1 mol·L-1NaCl混合溶液），流速1 mL·min-1，进样量: 1 mL; 检测器:紫外检测器; 检测波长为475 nm。

1.3.5 穿透曲线的绘制

精确量取上述配置的标准乳铁蛋白溶液（100μg·mL-1）10 mL。采用superloop 10 mL上样管进行上样，按照1.3.4的色谱条件进行动态吸附，观察紫外检测器变化，绘制穿透曲线。

1.3.6 乳铁蛋白标准曲线绘制

取9只试管，分别加入0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 mL的乳铁蛋白标准品溶液（质量浓度为100μg·mL-1）用0.15 mol·L-1NaCl溶液补足到10 mL，混合均匀，30 min内以0管为空白对照，以标准乳铁蛋白的质量浓度为横坐标，以乳铁蛋白标准品在475 nm处的紫外吸收峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，并计算曲线方程。

2 结果与讨论

2.1 穿透曲线的绘制

标准乳铁蛋白的在cm-sepharose fast flow 离子交换色谱上的穿透曲线如图1。试验在的流速1 mL·min-1下进样, 由图1可见上样体积达到1 mL时达到穿透点, 2 mL左右cm-sepharose fast flow离子交换色谱吸附基本达到饱和，之后吸附作用开始减弱，由此计算得到, 进样2 mL左右可以使预装柱充分吸附,当吸附达到饱和时,继续进样不仅对吸附量的增加效果不大, 而且由于溶质浓度急剧变大, 还会造成目标产物的损失，因此确定最大上样量为100μg·mL-1。

图1 cm-sepharose fast flow穿透曲线

2.2 精密度试验

精确吸取100 μg·mL-1的乳铁蛋白标准标准溶液6份，各5 mL，加入0.15 mol·L-1NaCl补足到10 mL于具塞试管中，按1.3.4中方法测定峰面积，计算RSD=1.039%。（相对标准偏差RDS=%）

表1 精密度试验结果（n=6）

2.3 重复性试验

精确吸取样品溶液6份各5 mL, 加入0.15 mol·L-1NaCl溶液补足到10 mL于具塞试管中，按1.3.4中测定峰面积，计算RSD=1.299%。

表2 重复性试验结果（n=6）

2.4 稳定性试验

精确吸取100μg·mL-1的乳铁蛋白标准标准溶液6份，各 5 mL，加入0.15 mol·L-1NaCl补足到10 mL于具塞试管中，分别在 0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4 h 按照1.3.4中方法测定峰面积，计算RSD=1.028%。

表3 稳定性试验结果（n=6）

2.5 加样回收试验

精确吸取样品溶液6份，各5 mL，精确吸取100 μg·mL-1的乳铁蛋白标准标准溶液6份，各5 mL，加入0.15 mol·L-1NaCl补足到20 mL于具塞试管中，按 1.3.4的色谱条件测定峰面积，计算平均加样回收率=96.56%。

表4 加样回收试验结果（n=6）

2.6 乳铁蛋白标准曲线的绘制

以乳铁蛋白的质量浓度为横坐标，以乳铁蛋白在475 nm处的紫外吸收峰面积为纵坐标（样品进样量1 mL），做乳铁蛋白的标准曲线（见图2），由此计算出的回归方程为=1.277 4+16.727 0，2=0.999。

图2 乳铁蛋白标准曲线

2.7 离子交换色谱起始缓冲液pH的选择

牛乳中乳铁蛋白的等电点约pH 7.8,缓冲液pH值与蛋白质等电点相差越大，蛋白质所带正电荷越多，与阳离子交换剂结合越牢固, 大于等电点乳铁蛋白会产生沉淀, 产物不能出现离子化。因此分别选择pH 6、6.5、7、7.5、8的磷酸缓冲溶液，进行动态吸附试验。试验过程中对乳铁蛋白回收率的变化情况进行监测,得到最佳起始缓冲液pH值。

试验研究过程中，在质量浓度相同pH值不同的流动相条件下，对牛初乳中所含的乳铁蛋白和其他蛋白质的分离程度进行了研究。结果发现不同pH值的流动相对样品的分离效果有一定的影响，并且乳铁蛋白的出峰时间也有所不同。

当起始缓冲液的pH值高于8.0时, 乳铁蛋白基本无法吸附在cm-sephrose fast flow色谱柱上，乳铁蛋白会与部分杂蛋白等组分一起率先被洗脱下来，这是因为起始缓冲液的pH值高于8.0时乳铁蛋白会产生沉淀,产物不能出现离子化碳水化合[20]。当起始缓冲液的pH值低于6.5时, 乳铁蛋白的出峰时间明显延后, 这是由于乳铁蛋白自身所带的电荷增加以及与离子交换柱之间的吸附能力增强所致。

采用pH值低于6.5的磷酸盐溶液作为起始缓冲液，洗脱时需要高浓度的盐溶液才可以将乳铁蛋白洗脱下来，由于盐溶液浓度过高易腐蚀泵头，并且浪费试剂，不适合作为首选。

当初始缓冲液的pH值低于8时，乳铁蛋白是带负电荷的，乳铁蛋白并不能与Cm-sepharose fast flow色谱柱交换电荷和吸附，因此乳铁蛋白和杂蛋白一起被洗脱下来。经过反复试验，发现起始缓冲液的pH值为7时，乳铁蛋白出峰时间较早，并且很好的与杂蛋白分离，可以获得了较高纯度的乳铁蛋白。

2.8 洗脱方式的选择

2.8.1 梯度洗脱

采用0~1.5 mol·L-1NaCl进行梯度洗脱,分离效果不佳,峰形较为扩散,采用梯度洗脱时,洗脱剂梯度变化的快慢和洗脱液浓度都会影响分离效果。而且梯度速率的变化控制也是比较困难的。

2.8.2 分布洗脱

配置浓度为0.3、0.5、0.7 mol·L-1NaCl溶液依次进行洗脱，这一步目的是先将杂蛋白与乳铁蛋白分离，并将杂蛋白洗脱下来，然后直接采用1.0 mol·L-1的 NaCl溶液作为第四个分步，快速洗脱乳铁蛋白组分。经过反复试验，采用0.3、0.5、0.7 mol·L-1NaCl溶液进行洗脱，可以将杂蛋白和乳铁蛋白完全分开，从而杂蛋白率先洗脱出来，直接采用1.0 mol·L-1NaCl 的高浓度的盐溶液作为第四个分步，可以快速洗脱乳铁蛋白组分，得到较为纯净的乳铁蛋白[21]。

2.8.3 单一浓度洗脱

从2.5.2分布洗脱过程中得出，直接采用1.0 mol·L-1NaCl溶液进行洗脱可以快速地将乳铁蛋白分离出来。从出峰效果分析，与分步洗脱有很好的一致性。 差别仅在于没有将杂蛋白没有分开，但这一步对乳铁蛋白的分离并未造成影响。单一浓度洗脱操作方便，节省时间和试剂。

3 结 论

乳铁蛋白作为一种新兴功能性食品配料，具有很高的营养价值，近年来乳铁蛋白的提取纯化工艺条件和应用研究在不断地增多，它已被成功的应用在酸奶、婴幼儿配方奶粉等产品中[22]。试验采用离子交换色谱法对牛初乳中的乳铁蛋白的含量进行了测定，按照方法学要求对试验的线性范围、精密度、重现性以及加样回收率等参数进行了确定。该方法方便快捷，准确可靠，对牛初乳中的乳铁蛋白进行了分离和检测，为下一步乳铁蛋白的纯化奠定了基础。

[1] JILLIAN C, KAREN E C, DORIT N, et al. Lactoferrin Is a Potent Regulator of BoneCell Activity and Increases Bone Forma－tion in Vivo[J]., 2003,145(9): 4366-4374.

[2] 王飞,窦文渊,石燕丽,等.反相高效液相色谱法测定婴儿奶粉中乳铁蛋白的含量[J].中国酿造,2012,31(07):167-168.

[3] 赵旭,徐晨,白素琴.乳品中乳铁蛋白检测现状及研究进展[J].北京农业,2014(18):9-11.

[4] 孙晶,张昊,郭慧媛,等.乳铁蛋白抑菌功能的研究进展[J].中国乳业,2012(10):38-41.

[5] 倪丹，王彩云，云战友. 乳铁蛋白的功能特性研究及应用进展[J].农产品加工，2011（6）：87-90.

[6] 张同童,柳晓丹,陈西,等.乳铁蛋白的研究进展[J].中国乳品工业, 2016, 44 (12):26-29.

[7] 康馨月,刘世财,郑珩.乳铁蛋白的多功能生物活性与临床进展[J].生物资源,2018,40(06):512-517.

[8] 张基亮,张兰威,马莺,等.乳铁蛋白促进骨健康作用的研究进展[J].中国乳品工业,2018,46(07):23-27.

[9] HOU J M, CHEN E Y, WEI S C，et al. Lactoferrin inhibits apoptosis through insulin-like growth factor I in primary rat osteoblasts[J]., 2014, 35: 523-530.

[10] 王觐, 长勇. 乳铁蛋白的生理功能及研究进展[J].中国食物与营养, 2008 (09): 52-54.

[11] GONZALEZ-CHAVEZ S A, AREVALO-GALLEGOS S, RASCON- CRUZ Q. Lactoferrin: structure, function and applications［J］., 2009, 33(4): 301-308.

[12] 夏明, 应铁进. 高效液相色谱检测乳制品中的乳铁蛋白含量[J].食品科学, 2010, 31 (02): 165-167.

[13] 朱慧莉, 黎锡流. 酶联免疫吸附法(ELISA)在乳制品检测中的应用[J].食品工业, 2001 (05): 44-45.

[14] 柳雨军, 胡新宇. 利用毛细管电泳法测定牛乳中乳铁蛋白含量[J].农产品加工(学刊), 2009 (02): 82-84.

[15] 李珊珊, 王加启, 魏宏阳, 等. 凝胶成像系统SDS-PAGE法测定乳及乳制品中乳铁蛋白[J]. 农业工程学报, 2008, 24 (S2): 283-288.

[16] 李姣,张施敬,佘之蕴,等.乳铁蛋白纯化和检测方法研究进展[J].广东化工,2014,41(14):123-124.

[17] 肖奕昕,赵善仓,董燕婕,等.乳铁蛋白生物学功能及其检测方法研究进展[J].中国乳品工业,2018,46(03):29-34.

[18] 赵旭,徐晨,白素琴.乳品中乳铁蛋白检测现状及研究进展[J].北京农业,2014(18):9-11.

[19] 涂茂林,杨戬,刘猛,等.乳铁蛋白检测方法研究进展[J].乳业科学与技术,2015,38(01):32-37.

[20] 任璐,龚广予,杭锋,等.采用HPLC测定乳铁蛋白质量浓度的方法研究[J].中国乳品工业,2009,37(02):49-52.

[21] 卢蓉蓉,许时婴,王璋,等.强阳离子交换色谱法从牛初乳中分离纯化乳铁蛋白的研究[J].食品科学,2007(07):48-53.

[22] 张艳杰.乳铁蛋白的功能特性及其在婴儿配方奶粉中的应用[J].中国乳品工业，2005，33（2）：33-36.

Determination of the Mass Concentration of Lactoferrin in Bovine Colostrum by Ion Exchange Chromatography

,,,

（Shenyang University of Chemical Technology, Shenyang Liaoning 110142, China）

An ion exchange chromatography method was developed to determine the mass concentration of lactoferrin in bovine colostrum. Using cm-sepharose fast flow pre-loaded column 5 mL, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 μg·mL-1standard lactoferrin solutions were chromatographically separated, with pH value of 7.0, 0.02 mol·L-1phosphate solution as the initial buffer, sample quantity 1 mL, flow rate 1 mL·min-1, 1 mol·L-1NaCl solution as eluent, detection wavelength 475 nm. The regression equation was=1.277 4+16.727 0,2=0.999, the linear range was 10~80 g·mL-1, and the average spike recovery rate was 96.56%. This method can not only isolate lactoferrin from bovine colostrum, but also determine the content of lactoferrin, and it is convenient, fast, accurate and reproducible.

Ion exchange; Colostrum; Lactoferrin; Detection

2020-10-21

刘佳欣（1995-），女，辽宁省丹东市人，研究方向：乳铁蛋白的提取及分离纯化。

TQO658.6+8

A

1004-0935（2020）03-0419-04