miR−208a促进非小细胞肺癌A549细胞增殖、侵袭和迁移的功能和机制研究

李新玲，吴振国，张立海，朱颀峰

肺癌是我国发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，其中非小细胞肺癌（NSCLC）约占肺癌的85%［1］。目前，NSCLC的治疗以外科手术结合放化疗、分子靶向治疗为主；尽管这些治疗方法对患者预后有所改善，但由于该病复发率高，5年生存率依然没有较大提高。侵袭和转移是肿瘤重要的生物学特征，也是造成肿瘤复发的关键因素，深入研究NSCLC侵袭和转移的机制是改善患者预后的关键。研究表明，miR−208a在肿瘤中的异常表达，参与影响乳腺癌［2−3］、结肠癌［4］、胃癌［5−6］等多种肿瘤的发生和发展，但在NSCLC中的报道少见。蛋白酪氨酸磷酸酶受体G（PTPRG）是蛋白酪氨酸磷酸酶家族的一员，主要参与调节细胞的生长、分化、周期以及肿瘤转化等生物过程。研究发现PTPRG过表达可抑制鼻咽癌细胞的生长和侵袭［7］，以及乳腺癌的进展［8］。本研究通过过表达和干扰NSCLC细胞miR−208a表达，探讨miR−208a对NSCLC细胞增殖、侵袭和迁移的影响，并验证miR−208a与PTPRG的靶向关系，为NSCLC的临床治疗提供新的思路和理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料人NSCLC细胞A549购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库；人肾胚细胞HEK−293T购自武汉普诺赛生命科技有限公司；RPMI 1640、胎牛血清、青/链霉素双抗、胰蛋白酶购自美国Gibco公司；CCK−8试剂盒、结晶紫染色液、细胞裂解液、BCA蛋白定量试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；Matrigel基质胶购自美国BD公司；鼠源GAPDH一抗、兔源PTPRG一抗、羊抗兔二抗、羊抗鼠二抗、ECL化学发光底物、SDS−PAGE蛋白上样缓冲液购自武汉爱博泰克生物科技有限公司；蛋白Marker、RNA提取试剂盒购自美国赛默飞公司；mRNA逆转录试剂盒和荧光定量试剂盒购自日本Takara公司、miRNA逆转录试剂盒（加尾法）购自上海冠泰生物科技有限公司；PVDF膜购自美国密理博公司；双荧光素报告酶试剂盒购自美国Promega公司。多功能酶标仪（Thermo公司，美国），电泳仪（六一仪器厂，北京），CO2细胞培养箱（松下，日本），实时荧光定量PCR（qPCR）仪（ABI，美国），倒置显微镜（Olympus，日本），超净工作台（苏洁医疗器械有限公司，苏州），高速冷冻离心机（贝克曼，美国）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养A549细胞采用含10%胎牛血清和1%青/链霉素的RPMI 1640培养基进行培养，细胞置于培养条件为37℃、5%CO2的培养箱中。每隔1～2 d进行换液，待细胞融合度达到80%～90%时，用胰蛋白酶消化，进行1∶3传代。

1.2.2 细胞转染及分组取处于指数生长期的A549细胞，接种于细胞培养板中。将细胞预培养12 h，待细胞融合度达到60%～80%时将培养基更换成无血清无双抗的RPMI 1640培养基，进行细胞转染。转染方法参照lipofectamine 2000试剂盒说明书进行操作。转染组包含4组：miR−208a mimic组、NC mimic组、miR−208a inhibitor组和NC inhibitor组。NC mimic，miR−208a mimic，NC inhibitor和miR−208a inhibitor均由广州锐博生物科技 有 限 公 司 合 成。序 列miR−208a mimic：5'−AUAAGACGAGCAAAAAGCUUGU−3'；miR−208a inhibitor：5'−UAUUCUGCUCGUUUUUCGAACA−3'；NC mimic：5'−UUCUC CGAACGUGUCACGUTT−3'；NC inhibitor：5'−CAGUACUU UUGUGUAGUACAA−3'。

1.2.3 CCK−8实验取处于指数生长期的A549细胞，以5×103个/孔接种于96孔板中。细胞预培养12 h后进行细胞转染实验。转染完成后，分别于0、24、48和72 h检测增殖情况。将10μL CCK−8溶液加入到96孔板中，在37℃下孵育1～4 h，用多功能酶标仪检测450 nm波长处光密度（OD）值，每组设置3个复孔。

1.2.4 划痕实验在6孔板背面用记号笔平行划下3条标记线，用于划痕实验记录位置。取转染后的4组细胞，以1×106/孔接种于6孔板中。用10μL枪头在细胞培养板中划下3条垂直于标记线的划痕。用PBS润洗，洗掉漂浮的细胞。选取3个划痕位置，分别于0 h和24 h进行拍照，记算细胞划痕迁移率。迁移率=（0 h划痕宽度−24 h的划痕宽度）/0 h划痕宽度×100%。

1.2.5 Transwell实验在Transwell板上室中提前加入Matrigel基质胶，在细胞培养箱中孵育2 h左右备用。4组细胞转染24 h后，胰蛋白酶消化，用400μL无血清细胞培养液重悬细胞。吸取100μL的细胞悬液，接种至Transwell上室，下室加入600μL含20%胎牛血清的RPMI 1640培养液。24 h后，吸取上室中的培养液，用脱脂棉花轻轻擦掉上室中未侵袭到底部的细胞。随后将小室置于4%多聚甲醛溶液中，于4℃固定20 min，然后用0.1%结晶紫溶液室温染色15 min。随机读取5个视野进行拍照，计算细胞侵袭数量。

1.2.6 生物信息学分析miR−208的靶基因应用PicTar（https://pictar.mdc−berlin.de）、miRanda（http://www.microrna.org/microrna/home.do）、Targetscan（http://www.targetscan.org/mamm_31/）和miRDB（http://mirdb.org/）4个数据库分析与miR−208a结合的下游靶基因，并通过维恩图（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）求交集。随后，通过GEPIA数据库（http://gepia.cancer−pku.cn/）检索PTPRG在肺腺癌（LUAD）和肺鳞癌（LUSC）中的表达量。

1.2.7 双荧光素报告酶实验通过PCR扩增PTPRG的3'UTR序列，克隆至pGL3质粒构建野生型质粒。随后用点突变试剂盒对miRNA与mRNA 3'UTR的结合位点的质粒进行点突变，得到突变型质粒。取指数生长期HEK−293T细胞，接种于24孔板中，细胞预培养12 h后进行细胞转染。将miR−208a mimic/miR−208a inhibitor与包含PTPRG的3'UTR序列的野生型/突变型质粒共同转染到HEK−293T细胞中，并用NC mimic和NC inhibitor作为对照。转染48 h后，参照试剂盒说明书检测各组细胞的荧光素酶活性，并用海肾荧光活性对实验结果进行标准化。

1.2.8 qPCR取各组转染48 h后的细胞，根据RNA提取试剂盒说明书进行操作，提取细胞总RNA。应用逆转录试剂盒逆转录成cDNA，置于−20℃保存。随后，利用qPCR检测mRNA和miRNA的表达水平，GAPDH和U6分别作为内参。反应体系为：SYBR premix 12.5μL，PCR上下游引物各0.5 μL，DNA模板2μL，dH2O 9.5μL，总体积25μL。反应条件：95℃预变性5 min；95℃变性5 s，60℃反应30 s，共40个循环。反应完成后，采用2−ΔΔCt法计算mRNA和miRNA的相对表达量。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物序列见表1。

1.2.9 Western blot各组细胞转染48 h后，弃去细胞培养上清，用冰PBS润洗细胞3次。加入细胞裂解液，冰上裂解30 min。随后12 000×g离心15 min，吸取上清，得到细胞总蛋白，用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量。定量后取30μg蛋白上样，进行10%SDS−PAGE凝胶电泳，待蛋白Marker完全分离后转移至PVDF膜上。随后用5%脱脂奶粉封闭2 h，用含1%吐温20的TBS洗膜，加入PTPRG一抗（1∶1 000）4℃孵育过夜后二抗（1∶10 000），37℃孵育2 h。最后加入ECL化学发光液进行显影，以GAPDH作为内参，用Image J对蛋白条带进行灰度分析。

1.2.10 PTPRG与miR−208a的靶向关系验证取处于指数生长期的A549细胞，设阴性对照组（si−NC组）、PTPRG敲低组（si−PTPRG组）和PTPRG敲低组+miR−208a干扰组（si−PTPRG+miR−208a inhibitor组）。各组培养12 h后分别进行转染，转染后采用CCK−8、Transwell实验和划痕实验检测PTPRG对A549增殖、侵袭和迁移的影响，qPCR和Western blot检测3组细胞PTPRG的mRNA和蛋白表达变化。si−NC和si−PTPRG均由广州锐博生物科技有限公司合成，si−PTPRG序列为5'−GTCCCTTTTGTCGCGGTAG−3'。

Tab.1 Primer sequence for qPCR表1 qPCR引物序列

1.3 统计学方法所有数据应用Graphpad 8.0软件进行统计学分析，计量资料均符合正态分布，以均数±标准差（x±s）表示，2组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用Tukey−t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR−208a的转染效率验证转染48 h后，miR−208a mimic组miR−208a表达水平较NC mimic组上调约10.28倍（t=16.950，P＜0.01），而miR−208a inhibitor组miR−208a表达较NC inhibitor组下调约74%（t=19.340，P＜0.01），见图1。

Fig.1 The transfection efficiency of miR−208a in A549 cells detected by qPCR图1 qPCR检测miR−208a在A549细胞中的转染效率

2.2 过表达和沉默miR−208a对A549细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响CCK−8结果显示，与NC mimic组相比，miR−208a mimic组在24、48、72 h细胞增殖能力明显升高（P＜0.05）；而沉默miR−208a后，miR−208a inhibitor组在24、48、72 h细胞增殖能力较NC inhibitor组明显下降，见表2。划痕实验和Transwell实验结果显示，与NC mimic组相比，miR−208a mimic组迁移率升高，细胞侵袭数增多（P＜0.01）；而沉默miR−208a后，miR−208a inhibitor组迁移率和细胞侵袭数较NC inhibitor组明显下降，见图2、3，表3。

Tab.2 Changes of the proliferation in A549 cells after overexpression and knockdown of miR-208a表2 过表达和敲低miR-208a后A549细胞增殖能力变化（n=3，OD450，x±s）

Tab.3 Changes of migration and invasion ability in A549 cells after overexpression and knockdown of miR-208a表3 过表达和敲低miR-208a后A549细胞迁移和侵袭能力变化 （n=3，x±s）

2.3 生物信息学分析寻找miR−208的靶基因通过PicTar、miRanda、Targetscan和miRDB共4个数据库分别查询miR−208a的靶基因，并通过维恩图求交集，最终得到38个交集基因，其中包括PTPRG。随后，通过检索GEPIA数据库发现PTPRG在肺腺癌和肺鳞癌中的表达量均高于癌旁组织，见图4。因此选择PTPRG作为后续的研究对象。

2.4 双荧光素报告酶实验结果双荧光素报告酶实验结果显示，miR−208a mimic/miR−208a inhibitor与PTPRG 3'UTR野生型质粒共转染后，细胞荧光素酶活性分别较各自对照质粒下降或升高（P＜0.01）。而miR−208a mimic/miR−208a inhibitor与PTPRG 3'UTR突变型质粒共转染HEK−293T细胞后，荧光素酶活性与各自对照质粒组相比差异无统计学意义（P＞0.05），见图5，表4。

Fig.4 Bioinformatics analysis of miR−208a target genes图4 生物信息学分析miR−208a的靶基因

Fig.5 Double luciferase reporter assay verified the 3'UTR of miR−208a targeting PTPRG图5 双荧光素报告酶实验验证miR−208a靶向PTPRG的3'UTR

Tab.4 Double luciferase reporter assay verified the binding of miR-208a with PTPRG表4 双荧光素报告酶实验验证miR-208a与PTPRG结合（n=3，x±s）

2.5过表达和敲低miR−208a对PTPRG mRNA和蛋白表达的影响qPCR和Western blot结果显示，与NC mimic组 相 比，miR−208a mimic组PTPRG的mRNA和蛋白表达均下调，mRNA水平下调约44%，蛋白水平下调约55%；而沉默miR−208a后，miR−208a inhibitor PTPRG的mRNA和蛋白分别上调3.22倍和2.22倍，见图6，表5。

Fig.6 The effect of miR−208a overexpression and knockdown on the expression of PTPRG detected by Western blot assay图6 Western blot检测过表达和敲低miR−208a对PTPRG蛋白表达的影响

Tab.5 The expression levels of PTPRG mRNA and protein in A549 cells after overexpression and knockdown of miR-208a表5 过表达和敲低miR-208a后A549细胞PTPRG mRNA和蛋白表达变化 （n=3，x±s）

2.6 miR−208a通过PTPRG促进A549的增殖、侵袭和迁移CCK−8实验发现，与si−NC组相比，si−PTPRG组能促进A549的增殖（P＜0.01），在加入miR−208a inhibitor后，si−PTPRG的促增殖作用减弱（P＜0.05），见表6。划痕实验和Transwell结果显示，与si−NC组相比，si−PTPRG组细胞迁移率升高，侵袭细胞数增多；在加入miR−208a inhibitor后，细胞迁移率和侵袭细胞数较si−PTPRG组出现下降，见图7、8，表7。

2.7 miR−208a靶向下调PTPRG的mRNA和蛋白表达qPCR和Western blot实验发现，与si−NC组相比，si−PTPRG组PTPRG mRNA和蛋白的表达水平均下 降（P＜0.01），在 加 入miR−208a inhibitor后，PTPRG的mRNA和蛋白表达水平较si−PTPRG组升高（P＜0.01）。见图9，表8。

Tab.6 Changes of proliferation ability of A549 cells after PTPRG knockdown and miR-208a interference表6 敲低PTPRG和干扰miR-208a后A549细胞增殖能力变化（n=3，OD450，x±s）

Tab.7 Changes of migration and invasion ability in A549 cells after knockdown PTPRG and interfere with miR-208a表7 敲低PTPRG和干扰miR-208aA549细胞迁移和侵袭能力变化 （n=3，x±s）

Fig.9 Western blot results showed that the expression of PTPRG mRNA and protein were regulated by miR−208a图9 Western blot验证PTPRG的基因和蛋白表达量受miR−208a调控

Tab.8 The expression levels of PTPRG mRNA and protein in A549 cells after knockdown PTPRG and interfere with miR-208a表8 敲低PTPRG和干扰miR-208a后PTPRG mRNA和蛋白表达变化 （n=3，x±s）

3 讨论

miRNAs在包括恶性肿瘤在内的多种疾病中异常表达，同时也参与多种细胞的生物学过程，包括早期发育、细胞增殖、凋亡、脂肪代谢和分化等。Zou等［2］发 现，miR−208a能 够 作 为 分 子 海 绵 被circRAD18吸附，从而促进三阴性乳腺癌的进展。Wu等［4］发现，miR−208a可通过靶向细胞程序性凋亡因子4（PDCD4）促进结肠癌的侵袭和迁移。Tang等［9］研究显示，miR−208a能够通过靶向p21促进人肺癌细胞增殖，增加细胞的耐药性。本研究发现，miR−208a过表达可促进A549细胞增殖、侵袭和迁移，敲低miR−208a则抑制A549细胞的侵袭和迁移，与上述报道一致。提示miR−208a在NSCLC中可能作为癌基因发挥促癌作用。

Wang等［10］研究表明，miR−490−3p通过靶向TMOD3的3'UTR，抑制肝癌细胞的侵袭和迁移。Zhou等［11］研究显示，miR−425−5p通过靶向PTEN的3'UTR，激活PI3K/AKT信号通路，促进肺癌细胞生长。本文通过生物信息学分析发现PTPRG是miR−208a下游的靶基因之一。Yu等［12］研究发现，环状RNA cMras通过调控PTPRG抑制肺腺癌的进展。Galvan等［13］发现PTPRG过表达能够显著抑制A549细胞的克隆形成。结合上述结果，笔者推测miR−208a可能通过靶向PTPRG发挥促癌作用。随后，本研究构建PTPRG 3'UTR野生型和突变型双荧光素报告基因质粒，并通过双荧光素报告酶实验发现miR−208a过表达能够降低PTPRG 3'UTR野生型的荧光素酶活性，而干扰miR−208a表达能够增加PTPRG 3'UTR野生型的荧光素酶活性。同时发现miR−208a过表达能够降低PTPRG mRNA和蛋白的表达水平；同样，干扰miR−208a能够促进PTPRG mRNA和蛋白的表达水平。以上结果证实PTPRG是miR−208a的靶基因。CCK−8、Transwell侵袭实验和划痕实验结果表明，干扰PTPRG能够促进A549细胞的增殖、侵袭和迁移，这与上述文献中PTPRG在肺癌中发挥的抑癌作用相符。在干扰PTPRG组中加入miR−208a inhibitor，则A549细胞的增殖、侵袭和迁移能力在一定程度上得到抑制。qPCR和Western blot结果显示，miR−208a inhibitor能够减弱PTPRG干扰处理后对PTPRG mRNA和蛋白的下调作用。以上结果证实PTPRG能够抑制A549的增殖、侵袭和迁移，且miR−208a可以通过抑制PTPRG的表达发挥促癌作用。

综上所述，过表达miR−208a能够通过靶向PTPRG的3'UTR促进A549细胞的增殖、侵袭和迁移。这一研究为明确NSCLC侵袭和迁移的机制提供了一定的理论基础和新的思路。

Fig.2 The effects of overexpression and knockdown of miR-208a on the migration of A549 cells detected by Scratch test图2划痕实验检测过表达和敲低miR-208a后A549细胞的迁移能力

Fig.3 The invasion ability of A549 cells after overexpression and knockdown of miR-208a detected by Transwell method(×40)图3 Transwell实验检测过表达和敲低miR-208a后A549细胞的侵袭能力（×40）

Fig.7 Scratch test showed that miR-208a affects A549 migration through PTPRG图7划痕实验验证miR-208a通过PTPRG影响A549的迁移

Fig.8 Transwell experiment showed that miR-208a affected the invasion of A549 through PTPRG(×40)图8 Transwell实验验证miR-208a通过PTPRG影响A549的侵袭（×40）