艾灸减轻新生小鼠缺氧缺血性脑病的作用及其机制研究

欧阳昕，徐优慧，陈明人，肖爱娇△

新生儿缺氧缺血性脑病（HIE）是指围产期内各种因素引起的缺氧和（或）缺血导致的脑损伤［1］。该病发病率较高，在发达国家约为0.15%，在发展中国家为1%～2%［2］，同时具有高致残率和死亡率的特点［3］。艾灸作为中医疗法的重要组成部分，在治疗急性脑卒中方面具有明显的优势和特色，并取得了一定疗效［4］。本课题组前期研究发现艾灸能明显减轻成年大鼠脑缺血再灌注损伤［5−6］，为艾灸治疗HIE提供了新思路。细胞凋亡参与了HIE的发病过程［7］，其中caspase−9、caspase−3分别是细胞凋亡启动、执行的关键因子。本课题组前期也发现HIE小鼠脑组织凋亡细胞数明显增加［8−10］。艾灸能否通过减少脑细胞凋亡进而减轻新生小鼠HIE尚不明确。本研究通过建立新生小鼠HIE模型，观察艾灸对小鼠脑组织细胞凋亡、caspase−9和caspase−3表达的影响，以探讨艾灸对新生小鼠HIE的抗细胞凋亡效应和机制。

1 材料与方法

1.1 材料清洁级健康成年ICR小鼠12只，购自江西中医药大学实验动物科技中心［SYXK（赣）2017−0004］。按雌鼠∶雄鼠=3∶1合笼，雌鼠孕期为21 d，待其自然分娩，小鼠出生当日计为P0，使用P7（出生后第7天）新生小鼠55只（不限雌雄）。主要试剂与仪器：凋亡原位检测试剂盒（Millipore），兔抗小鼠caspase−9（Cell Signaling Technology），A11011山羊抗兔IgG（Invitrogen），caspase−3放射免疫检测试剂盒（北京华英生物技术研究所），CM1950冰冻切片机和Leica2000荧光显微镜及图像分析软件（Leica），XH−6020全自动放免计数仪（西安核仪器厂）。

1.2 方法

1.2.1 实验分组及模型制备将所有新生鼠按随机数字表法分为假手术组（Sham组，17只）、模型组（HI组，21只）和艾灸组（MOX组，17只）。Sham组仅行颈部手术，不做缺血、缺氧处理。HI组闭合右侧颈总动脉造成缺血，并置于缺氧箱进行缺氧处理。参照Rice等［11−12］的方法，结合本课题实际情况，8%O2处理100 min建立HIE模型。MOX组造模方法同HI组，并于缺氧后行艾灸治疗。

1.2.2 治疗方法MOX组施以艾灸疗法：用长15 cm、直径4 mm的艾条距大椎穴20 mm处悬灸，该穴定位参照文献［13］。首次治疗于造模后2 h进行，35 min/次，1次/d，连续治疗3 d。

1.2.3 脑组织形态学观察于术后3 d，各组分别取3只鼠给予4%异氟烷吸入麻醉后迅速取脑，拍照，随后置于30%多聚甲醛蔗糖液中固定、脱水；待下沉后将脑取出，用PBS清洗后行冰冻切片，厚度35μm，最后将所有切片置于保护液中备用。使用时，随机从每个样本中抽取2片脑片，用含DAPI的封片剂封片后显微镜下观察拍照。

1.2.4 TUNEL染色检测脑组织细胞凋亡动物数量和取材方法同1.2.3。从保护液中抽取脑片，每个样本取2片，PBS清洗后末端脱氧核糖转移酶（TdT）工作液于37℃孵育1 h，加入终止液；PBS清洗后加入罗丹明标记物，室温下放置30 min，PBS清洗，含DAPI的封片剂封片。TUNEL染色后使用荧光显微镜观察并拍照。Image J软件计数400倍视野下的阳性凋亡细胞数。

1.2.5 脑组织caspase−9阳性细胞检测动物数量和取材方法同1.2.3。从保护液中抽取脑片，每个样本取2片，PBS漂洗后山羊血清封闭，加入兔抗小鼠caspase 9一抗（1∶500，阴性对照不加一抗，用PBS代替）于4℃孵育过夜；次日PBS清洗，加入山羊抗兔二抗（1∶500）于室温下避光孵育1 h，PBS清洗，含DAPI的封片剂封片。免疫荧光染色后荧光显微镜观察、拍照。Image J软件计数整个200倍视野下的caspase−9阳性细胞数。

1.2.6 脑组织caspase−3含量检测于术后3 d，各组分别取8只鼠进行脑组织caspase−3含量检测。给予小鼠异氟醚吸入麻醉后迅速在冰上取脑，分离患侧大脑半球，匀浆后采用放射免疫分析法测定脑组织总蛋白和caspase−3含量。

1.3 统计学方法统计分析用Graphprism 5.01软件，符合正态分布的计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较用单因素方差分析，组间多重比较用Tukey法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组小鼠脑组织形态学改变

2.1.1 大体观察Sham组脑组织红润，脑沟及脑回清晰，未出现梗死灶；HI组右半球见大面积梗死灶，脑组织液化、坏死，脑沟、脑回消失；MOX组右半球可见小面积梗死灶，脑沟变浅、脑回变宽，见图1。

Fig.1 Gross brain morphological structure in three groups图1 小鼠脑大体形态

2.1.2 镜下观察Sham组右侧脑组织排列致密，脑细胞无明显脱落；HI组患侧脑组织排列疏松，脑细胞脱落甚多；MOX组患侧脑组织排列较致密，脑细胞脱落较少，见图2。

2.2 3组小鼠脑组织细胞凋亡情况TUNEL阳性细胞呈红色，与Sham组相比，HI组脑组织凋亡细胞数明显增多；与HI组相比，MOX组脑组织凋亡细胞数明显减少，见图3、4。

Fig.4 Comparison of the TUNEL−positive cells in brain tissues between three groups图4 各组小鼠脑组织TUNEL阳性细胞数比较

2.3 3组小鼠脑组织caspase−9表达情况caspase−9阳性细胞呈绿色，与Sham组相比，HI组脑组织caspase−9阳性细胞数明显增多；与HI组相比，MOX组脑组织caspase−9阳性细胞数明显减少（P＜0.01），见图5、6。

Fig.6 Comparison of the expression of caspase−9 in brain tissues between three groups图6 各组小鼠脑组织caspase−9表达水平比较

2.4 3组小鼠脑组织caspase−3含量比较HI组和Sham组脑组织caspase−3含量差异无统计学意义；MOX组caspase−3含量明显低于HI组，见图7。

3 讨论

针对新生儿HIE的治疗，现代医学主要采用低温疗法［14］、高压氧疗法［15］等，但都存在一定的局限性。低温疗法是目前唯一被循证医学证实有效治疗HIE的方法，具有降低病死率和致残率、改善神经症状等优势［16］，许多发达国家的新生儿重症监护病房（NICU）已将其作为治疗新生儿HIE的常规方法。但是针对足月小样儿以及早产儿，低温疗法的效果并不明显［17］，且接受低温治疗的患儿中仍有40%～50%死亡或伴有严重的神经系统发育异常［18］，受益的患者仅占1/6［19］。而高压氧疗法在治疗新生儿HIE则会出现晶体后纤维增生等不良反应［20］。

Fig.7 Comparison of the content of caspase−3 of brain tissues between three groups图7 各组小鼠脑组织caspase−3含量比较

为了克服现代医学治疗新生儿HIE的局限，本课题组在中医疗法方面进行了探索。祖国传统医学素有病变在脑，首取督脉之说。大椎穴为督脉上的要穴，且具有调节手足阳经气血和补益脑髓等作用。因此，笔者选取大椎穴对HIE新生小鼠进行艾灸治疗，发现艾灸大椎穴可以缩小新生小鼠HIE后的脑梗死灶、减轻缺氧缺血性脑损伤。然而，艾灸减轻缺氧缺血性脑损伤的作用机制尚不明确。

新生儿HIE的发病机制涉及细胞凋亡、氧化应激等方面［21］。其中，细胞凋亡在新生儿HIE的发病过程中起重要作用［7］，尤其在未成熟脑中作用更明显［22］。本课题组前期研究发现HIE小鼠脑组织凋亡细胞数明显增加［8−9］。本研究也得到了类似的结果，通过艾灸治疗后脑组织凋亡细胞数较HI组明显减少，提示艾灸可能通过减少细胞凋亡达到减轻缺氧缺血性脑损伤的目的。

细胞凋亡由复杂的胞内级联反应组成，Bcl−2家族、caspase家族等都与细胞凋亡相关联。其中，caspase家族自始至终贯穿细胞凋亡的整个过程，其既是启动者，又是调控者，更是执行者［23］。细胞凋亡主要有内源性途径（又称线粒体依赖性凋亡通路）和外源性途径（也称死亡受体介导的凋亡通路）两种［24］。其中线粒体介导的调亡在哺乳动物细胞的多种生物学过程中起关键作用［25］。当细胞受刺激后，细胞色素C（Cyt C）从线粒体膜间隙释放到细胞质中，然后与细胞凋亡激活因子1（Apaf−1）结合，接着活 化caspase−9前 体。活 化 后 的caspase−9激 活caspase−3，后者执行凋亡过程，最终导致细胞凋亡［26］。本研究结果显示，与HI组相比，MOX组小鼠脑组织中caspase−9和caspase−3表达水平明显下降，提示艾灸可能通过降低脑组织caspase−9和caspase−3表达水平，从而减少细胞凋亡。

综上所述，艾灸可能通过降低caspase−9和caspase−3表达水平、减少细胞凋亡而达到减轻新生小鼠HIE。目前针对艾灸治疗新生儿HIE机制的研究较少，本研究为深入探究艾灸治疗新生儿HIE的作用机制提供了可借鉴的依据。

Fig.2 Results of DAPI staining of brain sections in three groups(×400)图2各组小鼠脑组织切片DAPI染色结果（×400）

Fig.3 Results of TUNEL staining of brain tissues in three groups(×400)图3各组小鼠脑组织TUNEL染色结果（×400）

Fig.5 Results of caspase-9 expression detected in brain tissues in three groups(immunofluorescent staining,×200)图5各组小鼠脑组织caspase-9表达结果（免疫荧光染色，×200）