Linc00355在结肠癌中表达上调并促进肿瘤细胞增殖和侵袭

李玖明，崔凯飒，王 雪，黄朝晖

结肠癌作为临床常见的一种恶性肿瘤，近年来发病率和死亡率均呈现逐年升高的趋势[1]。结肠癌的发病机制复杂，涉及遗传学、表观遗传学以及肿瘤微环境等多个因素的调控。在生物体中，通常可根据其是否具备蛋白编码功能将RNA分为编码RNA及非编码RNA。近年研究已证实，非编码RNA并非是基因转录的“噪音”，而是具有重要的生物学功能[2]。其中长度＞200 bp的长链非编码RNA（long noncoding RNA，lncRNA）广泛存在于细胞核和细胞质中。LncRNA可通过多种机制调控生理、病理过程，不仅影响细胞生长、分化、迁移和凋亡等功能，还在疾病的诊断和治疗中具有重要的应用价值。

有研究发现，Linc00355在胃癌中表达上调，并通过调节Wnt/β-连环蛋白（β-catenin）通路促进细胞增殖[3]。在头颈部鳞状细胞癌中高表达的Linc00355可通过调控微RNA（microRNA，miR）-195/HOXA10信号轴促进细胞迁移、侵袭及上皮-间质转化[4]。但Linc00355在结肠癌中的功能和机制目前尚不清楚。

本研究基于肿瘤基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）等数据库结肠癌转录组数据，发现Linc00355在肿瘤中表达显著上调，并可能是一个结肠癌潜在的新预后指标。通过生物信息学方法预测与Linc00355相关的靶基因，进行基因本体（Gene Ontology，GO）功能富集分析，预测Linc00355在结肠癌中的功能以及分子调控机制，并通过细胞实验初步探讨Linc00355对结肠癌细胞生物学功能的影响，以期为结肠癌的诊断和治疗提供新的靶点。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂及仪器

结肠癌细胞株HCT116购自美国菌种保藏中心。DMEM购自美国HyClone公司，胰蛋白酶、青霉素/链霉素购自中国碧云天生物技术公司，胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购自美国Gibco公司，LipofectAMINE 2000购自美国Invitrogen公司。CCK-8购自日本Dojindo公司，RNAiso和PrimeScript反转录试剂盒、SYBR PCR Master Mix购自南京诺唯赞生物科技公司，Transwell小室购自美国Corning公司。Linc00355小干扰及阴性对照购自中国吉玛基因公司。

实时荧光定量PCR仪器（型号：SLAN-96P）为上海宏石医疗科技有限公司产品，光学显微镜（型号：EVOS M7000）为美国赛默飞公司产品，全自动酶标仪（型号：Bio-Tek ELX800）为美国宝特公司产品。

1.2 生物信息学分析

首先从TCGA数据库中下载473例结肠癌患者（包括473例癌组织及41例配对的癌旁正常组织）测序数据及患者临床资料。首先将下载的数据整理成基因表达矩阵文件，利用R语言EdgeR包对样本分别进行LncRNA在肿瘤中的差异分析，选取差异表达P＜0.05且|Log2Fold Change，Log2FC|＞2的基因作为差异表达LncRNA用于后续分析。利用基因表达综合（Gene Expression Omnibus，GEO）芯片数据库（GSE23878、GSE41328和GSE39582）中Linc00355的表达数据绘制差异表达图，并根据临床信息进行Kaplan-Meier生存分析并绘制生存曲线。进一步采用共表达方法预测Linc00355的靶基因。利用R语言Limma包对表达矩阵分析，筛选与Linc00355表达具有相关性的mRNA（P＜0.05，相关系数R＞0.3）。利用GEO芯片数据库（GSE38832）中Linc00355、黑色素瘤抗原A3（melanoma antigen-A3，MAGE-A3）和周期蛋白依赖性激酶抑制因子CDKN1A的表达数据绘制相关性散点图（P＜0.05，相关系数R＞0.3）。最后使用DAVID数据库，对54个与Linc00355相关的mRNA进行GO功能富集分析。使用R语言Ggplot2包进行可视化作图。

1.3 细胞培养及转染

HCT116细胞使用含10% FBS、100 mg/L青霉素/链霉素的DMEM培养液，置于37 ℃、CO2体积分数为5%的细胞培养箱中进行培养。待细胞贴壁且占满培养皿底面积的80%～90%时传代。HCT116细胞用胰蛋白酶消化传代后，按3×105个/孔的密度接种于6孔板中。根据LipofectAMINE 2000转染试剂说明书分别将阴性对照siRNA（siNC）和2条针对Linc00355的siRNA（siLinc00355-1和siLinc00355-2）转入HCT116细胞中。siNC正义链序列为5’-UUCUUCGAAGGUGUCACGUTT-3’，反义链序列为5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’；siLinc00355-1正义链序列为5’-CCACUGACAGCAGAGUCUUTT-3’，反义链序列为5’-AAGACUGCUGUCAGUGGTT-3’；siLinc00355-2正义链序列为5’-GGGAAACUCUCUACGCUAUTT-3’，反义链序列为5’-AUAGCGUAGAGAGUUUCCCTT-3’。

1.4 实时荧光定量PCR

收集HCT116细胞（5×106个），用PBS清洗3遍，采用RNAiso试剂盒提取细胞总RNA，反转录合成cDNA后，进行实时荧光定量PCR检测，以β-actin基因作为内参照；PCR扩增反应条件为95 ℃预变性5 min，95 ℃ 30 s、95 ℃5 s、60 ℃ 30 s，共40个循环。以2－ΔΔCt值表述目的基因的相对表达水平。β-actin基因上游引物序列为5’-AGTGTGACGTGGACATCCGCAAAG-3’，下游引物序列为5’-ATCCACATCTGCTGGAAGGTGGAC-3’，Linc00355上游引物序列为5’-GCAGACAGTTGTATCACGCC-3’，下游引物序列为5’-TCCGGAAGGTTGAGTGGTTG-3’；MAGE-A3基因上游引物序列为5’-GGCAGGCCTCCTGATAATCG-3’，下游引物序列为5’-GGTGAGCAGCTTCTTGGGAT-3’；CDKN1A（p21）基因上游引物序列为5’-TCTAGGAGGGAGACACTGGC-3’，下游引物序列为5’-TGTCTGACTCCTTGTTCCGC-3’。

1.5 CCK-8法和克隆形成实验检测细胞的增殖能力

HCT116细胞分别转染siNC、siLinc00355-1和siLinc00355-2 24 h后收集3组细胞，以2×103个/孔的密度接种于96孔板中，分别于1、2、3、4和5 d时加入CCK-8试剂，在酶联免疫检测仪波长450 nm处检测各孔细胞的D值，并绘制细胞增殖曲线，具体检测流程参阅试剂盒操作说明。

收集上述转染24 h后对照组和实验组细胞，以1×103个/孔的密度接种于6孔板中，静置培养7～14 d。用10%甲醛溶液固定细胞30 min后，加入1%的结晶紫染色20 min，计数每个孔内的克隆数并拍照记录（每个克隆含有50以上的细胞，直径为0.3～1.0 mm）。

1.6 Transwell小室法检测细胞的迁移及侵袭能力

收集上述转染24 h后的3组细胞，用无血清DMEM培养液制成细胞悬液，以1×105个/室的密度接种于Transwell小室的上室中，并在Transwell下室中加1 mL完全培养液。培养24 h后除去培养液，用10%甲醛溶液固定细胞20 min，加入0.1%结晶紫染色20 min。清水冲洗去除染色液，用棉签擦去未穿过小室膜的细胞。在倒置光学显微镜下（放大倍数为100倍）计数穿过小室膜的细胞数，分析细胞的迁移能力。

Transwell小室侵袭实验，在Transwell小室的上室中预先铺设Matrigel，其余检测流程同Transwell小室迁移实验，Transwell小室的上室中接种3组细胞48 h后，在倒置光学显微镜下（放大倍数为100倍）计数穿过小室膜的细胞数，分析细胞的侵袭能力。

1.7 统计学方法

采用GraphPad Prism 7.0统计学软件处理研究数据，计量资料以表示，各实验均独立重复3次。采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，多组间均数比较采用非参数检验（Kruskal-Wallis秩和检验）。组内两两比较采用Mann-WhitneyU检验，相关性分析采用Pearson线性相关分析；采用COX多因素回归分析结肠癌患者死亡的影响因素。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 结肠癌中差异表达的lncRNA

在TCGA数据库中下载基因表达矩阵文件并提取结肠癌患者的临床信息；lncRNA的数据（包括473例癌组织及41例配对癌旁正常组织），利用R语言edgeR包，根据差异倍数|Log2FC|＞2和校正P＜0.05筛选出差异表达的lncRNA。热图（图1A）和火山图（图1B）分析结果显示，与癌旁正常组织相比，在结肠癌中有871个lncRNA表达上调（图中红色标注）和259个lncRNA表达下调（图中绿色标注）。

在这些差异表达的lncRNA中，根据生存分析筛选后发现，Linc00355表达与结肠癌患者不良预后相关，且在结肠癌中的功能未知，故选择Linc00355进行后续研究。

2.2 Linc00355表达的预后价值

利用TCGA数据库和GEO数据库中的3组芯片（GSE23878、GSE41328和GSE39582）数据分析Linc00355在结肠癌中的表达和预后情况。结果（图2A、图2B和图2C）显示，Linc00355在结肠癌组织中高表达（P＜0.01，P＜0.01和P＜0.05）。

对TCGA数据库检索获得的447例结肠癌（剔除26例信息不全数据）分析结果显示，Linc00355表达水平与患者的TNM分期成正相关（P＜0.0001）（图2D），且Linc00355高表达患者的总生存期（overall survival，OS）（图2E）和疾病特异性生存期（disease-specific survival，DSS）（图2F）均明显缩短（P值均＜0.05），GSE39583数据库来源的患者同样显示（图2F），Linc00355高表达者的OS明显缩短（P＜0.05）。

采用Mann-WhitneyU检验分析TCGA数据库中Linc00355表达水平与临床病理特征之间的关系。结果（表1）显示，结直肠癌组织中Linc00355表达与患者性别、年龄、T分期均无显著相关性（P值均＞0.05），但与患者的临床N、M分期及病理TNM分期有显明显的相关性（P＜0.01）。

COX多因素风险回归模型分析结果（表2）显示，Linc00355是结肠癌患者生存期的独立预测因子，其表达水平越高，患者的OS期越短[风险比（hazard ratio，HR）＝1.601，95%可信区间（confidence interval，CI）为1.008～2.542，P＝0.046]。此外，年龄和T分期也是结肠癌患者OS期的影响因素。

2.3 Linc00355共表达mRNA网络的构建与GO功能富集分析

为了探究Linc00355影响患者预后的原因，通过共表达分析预测与Linc00355相关的mRNA，共发现54个mRNA与Linc00355表达有相关性（图3A），相关系数见表3。对这些基因进行功能富集分析，发现这些基因富集于如p53的信号转导、细胞蛋白分解代谢过程，泛素蛋白转移酶活性、蛋白质乙酰化、蛋白质小泛素相关修饰物（small ubiquitin-related modifier，SUMO）化和细胞衰老等信号通路（图3B）。这一结果提示，Linc00355在结肠癌细胞的增殖、迁移及侵袭等过程中可能发挥重要调控作用。

Fig.1 Differentially expressed long non-coding RNA (lncRNA) in colon cancer based on The Cancer Genome Atlas (TCGA) dataset.A:Heat map of differentially expressed lncRNAs in colon cancer of TCGA database;B:Volcano map of differential lncRNA in colon cancer (red indicates up-regulation,green indicates down-regulation).logFC:Log2Fold change;FDR:False discover rate.图1 基于TCGA数据库获得结肠癌中差异表达的lncRNA（A为热图；B为火山图；红色代表在癌组织中表达上调，绿色代表在癌组织中表达下调）

Fig.2 The correlation between Linc00355 expression and the prognosis of colon cancer patients.A-C:Linc00355 was up-regulated in tumor tissues compared with normal tissues in colon cancer cohorts of The Cancer Genome Atlas (TCGA) database (A) and Gene Expression Omnibus (GEO) database [GSE23878 (B)and GSE41328 (C)];D:Linc00355 expression was related to TNM stage;E-G:Survival analyses based on the expression of Linc00355 in the colon cancer cohorts of TCGA [overall survival (OS) (E) and disease-specific survival (DSS) (F)]and GSE39582 [OS (G)].图2 采用TCGA及GEO数据库分析Linc00355表达与结肠癌患者预后的相关性

2.4 Linc00355对结肠癌细胞生物学功能的影响

实时荧光定量PCR检测结果（图4A）显示，与对照组比较，siLinc00355-1和siLinc00355-2组HCT116细胞中Linc00355的表达水平均明显下调（P值均＜0.001），提示2条siRNA均可有效沉默Linc00355的表达。

CCK-8法（图4B）和克隆形成实验（图4C）检测结果显示，敲低Linc00355表达后，siLinc00355-1和siLinc00355-2组HCT116细胞的增殖能力和克隆形成能力均明显降低，差异有统计学意义（P值均＜0.001）。

Transwell小室法检测结果（图4D）显示，敲低Linc00355表达后，HCT116细胞的迁移和侵袭能力均明显降低（P值均＜0.001）。

上述结果提示Linc00355可促进结肠癌细胞增殖、迁移和侵袭能力。

表1 Linc00355表达水平与结直肠癌患者临床病理特征的相关性Table 1 Correlation between Linc00355 expression and the clinicopathological characteristics of patients with colon cancer Total＝447,n

表2 多因素COX风险模型分析Linc00355表达与结肠癌患者OS期的关系Table 2 Multivariate COX risk model analysis of the relationship between the expression of Linc00355 and the overall survival (OS) of patients with colon cancer

Fig.3 Analysis of mRNA co-expressed network of Linc00355 and Gene Ontology (GO) function enrichment analysis.A:Co-expression network of Linc00355;B:GO enrichment analysis of Linc00355 coexpressed genes.图3 Linc00355共表达mRNA网络（A）与GO功能富集分析结果图（B）

表3 前20条Linc00355相关的共表达mRNATable 3 Linc00355 co-expression related mRNAs (TOP20)

Fig.4 Silencing Linc00355 expression inhibits the proliferation,migration and invasion of colon cancer HCT116 cells.A:The expression level of Linc00355 in HCT116 cells transfected with siRNA targeting Linc00355 (siLinc00355-1 and siLinc00355-2) was detected by real-time fluorescent quantitative PCR,the expression level of Linc00355 was significantly reduced;B-C:The cell proliferation was detected by CCK-8 (B) and clone formation method (C),the cell proliferation ability was significantly reduced in Linc00355 knockdown HCT116 cells;D:The cells migration and invasion abilities were detected by Transwell method,the cells migration and invasion abilities were inhibited in Linc00355 knockdown HCT116 cells.HCT116 cells were transfected with negative control (NC)-siRNA (siNC) as the control.***P＜0.001 (n=3).图4 沉默Linc00355表达抑制结肠癌HCT116细胞的增殖、迁移和侵袭能力

2.5 Linc00355可能通过调控MAGE-A3基因影响p53信号通路

为了验证上述共表达分析结果，选择评分最高的MAGE-A3及其下游靶基因CDKN1A（p53通路关键信号分子）进行了验证。基于GSE38832数据集分析发现，Linc00355与MAGE-A3的表达存在显著正相关（R＝0.552 3，P＜0.000 1）（图5A），而与CDKN1A的表达水平则呈显著负相关（R＝－0.406 8，P＜0.001）（图5B）。

Fig.5 The relationship between Linc00355,melanoma antigen (MAGE)-A3 and CDKN1A.A:Linc00355 was positively correlated with the expression of MAGE-A3 in colon cancer (R=0.552 3,P＜0.000 1);B:Linc00355 was negatively correlated with the expression of CDKN1A (R=-0.406 8，P＜0.001);C.Silencing Linc00355 expression could inhibit the expression of MAGE-A3 and promote the expression of CDKN1A.***P＜0.001 (n=3).图5 Linc00355与MAGE-A3和CDKN1A mRNA表达的相关性

实时荧光定量PCR检测结果（图5C）显示，与对照组比较，2个敲低Linc00355表达组HCT116细胞中MAGE-A3 mRNA的表达水平均明显下调（P值均＜0.001），而CDKN1A mRNA的表达水平均明显上调（P值均＜0.001）。

上述结果提示，Linc00355可能通过影响MAGE-A3基因的表达，进而调控抑癌因子p21的表达，从而促进结肠癌的发生和发展。

3 讨论

结肠癌是全球第3大常见的恶性肿瘤，居肿瘤相关死因第2位。据2020年统计结果显示，将有超过190万例新增结直肠癌病例和935 000例死亡病例，约占癌症新发和死亡病例的10%[5]。研究表明。LncRNA的失调可能与肿瘤的发生、发展、转移、耐药及多种生物学表型相关[6]。吕梦佳等[7]发现，在非小细胞肺癌患者血浆中lncRNA MALAT1的表达水平明显下调，lncRNA-ATB的表达明显上调，血浆MALAT1及ATB可作为非小细胞肺癌的诊断指标。曾明曦等[8]发现，胃癌组织中lncRNA RP11-513G11.1的表达水平显著高于癌旁组织及正常胃组织，与胃癌患者的TNM分期、淋巴结转移、远处转移、肿瘤分化及生存状态显著相关。

LncRNA作为结肠癌生物标志物和治疗靶点的潜能同样不容忽视。SVOBODA等[9]发现，结肠癌患者血液中的lncRNA HOTAIR的表达水平显著高于健康对照，且血液中HOTAIR的表达水平与患者的TNM分期、组织学分级以及OS期均有相关性。本课题组前期发现，在结直肠癌中高表达的lncRNA FEZF1-AS1通过结合并促进丙酮酸激酶2蛋白的稳定性，从而调控糖酵解和信号转导及转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）信号通路，进而促进肿瘤的发生和发展[10]。并发现lncRNA UCA1和Linc00152分别通过调控miR-204-5p和miR-139-5p的表达促进结直肠癌的增殖和化疗耐药[11]。此外，还发现lncRNA SNHG6在结直肠癌中发挥促癌作用，且SNHG6的表达可作为一个新的不良预后指标[12]。

本研究首次发现，Linc00355可能是与结肠癌预后相关的新生物标志物。Linc00355在结肠癌组织呈现高表达，并与患者的不良预后相关；沉默Linc00355的表达水平体外可抑制结肠癌细胞增殖、迁移及侵袭能力，提示Linc00355在结肠癌中发挥癌基因功能。随后，基因共表达网络及信号通路富集提示，Linc00355可能与细胞蛋白分解代谢、蛋白质泛素化、乙酰化、苏木化，p53信号转导及细胞衰老等多个生物学过程相关。而蛋白质修饰、p53信号转导及细胞衰老与肿瘤的发生和发展密切相关。本研究中进一步验证发现，沉默Linc00355表达可上调MAGE-A3 mRNA的表达水平。有研究表明，MAGE-A3可通过调控p53抑癌因子，影响p21、细胞周期蛋白D1（cyclin D1）及Bax的表达并调控与细胞增殖、凋亡相关的信号通路[13]。上述结果提示，Linc00355可能通过MAGE-A3基因影响p53信号通路进而影响结肠癌细胞的增殖。关于Linc00355调控结肠癌发生和发展的具体功能及机制的深入尚需进一步研究。

综上所述，本文结果提示Linc00355有望成为一种新的结肠癌患者的预后标志物和治疗靶点。