LncRNA MNX-AS1在非小细胞肺癌组织中的表达及临床意义

刘高峰，张 勇，张小贞，汤光耀，李保田，王保健

(联勤保障部队第九八八医院心胸外科，河南 郑州 450042)

据2018年全球癌症统计数据报告显示，肺癌是目前全球癌症发病率和死亡率最高的恶性肿瘤[1]。非小细胞肺癌(NSCLC)是肺癌最常见的类型，占全部肺癌的85%左右[2]。由于缺乏早期临床症状，多数患者就诊时已属晚期，治疗后易发生复发和转移，导致患者5年生存率较低[2,3]。因此探究NSCLC发生发展的机制，寻找可能的基因治疗靶点对NSCLC的诊断和治疗具有重要意义。近年来研究表明，长链非编码RNA(lncRNA)在多种恶性肿瘤中异常表达，参与肿瘤的生长、转移、复发等过程，在肿瘤的发生发展中发挥着癌基因或抑癌基因的作用[4]。LncRNA MNX1-AS1，又称为CCAT-5，在卵巢癌、肝癌、恶性胶质瘤中异常高表达，与其增殖、转移及预后密切相关[5,6]。目前关于MNX1-AS1与NSCLC发生发展的研究较少。本研究拟通过检测MNX1-AS1在NSCLC组织中的表达情况，分析其表达水平与NSCLC患者临床病理特征及预后的关系，探讨MNX1-AS1在NSCLC发生发展及预后中的生物学功能。

1 资料与方法

1.1研究对象:收集2015年6月至2017年6月在联勤保障部队第九八八医院经病理组织学确诊并经根治性或姑息性切除手术的180例NSCLC患者的原发病灶及癌旁组织标本。所有组织标本均置于液氮中保存。纳入标准：经组织病理学检查确诊为NSCLC；术前未进行放、化疗及其他抗肿瘤治疗；患者临床病理资料及随访资料完整；排除合并有其他部位恶性肿瘤者；排除恶化严重，生存时间≤3个月的患者。其中其中男118例，女62例，年龄30-74岁，平均年龄(52.93±7.39)岁；病理类型：鳞癌79例，腺癌101例；组织分化程度：高分化42例，中分化55例，低分化83例；TNM分期：Ⅰ/Ⅱ期55例，Ⅲ期125例；肿瘤大小：<3cm 94例，≥3cm 86例；淋巴结转移有95例。所有标本采集均告知患者并签署知情同意书，本研究经联勤保障部队第九八八医院伦理委员会批准。

1.2实时定量PCR检测NSCLC组织及癌旁组织中MNX1-AS1的表达:采用TRIzol试剂(美国Invitrogen公司)提取组织总RNA，经紫外分光光度计(DU800,美国Beckman公司)鉴定OD260/OD280为1.8-2.0，并测定浓度用于后续实验。按照PrimeScriptTM RT Reagent kit(日本TaKaRa公司)说明书将中RNA逆转录为cDNA。以cDNA为模板，采用SYBRGreen qPCR Master Mix(日本Toyobo公司)说明在实时荧光定量PCR仪(7300HT，美国ABI公司)上进行PCR扩增。引物序列由上海生工生物工程有限公司合成，序列如下：MNX1-AS1，上游引物：5'-CCCGCATTTTCAGATTCAC-3'，下游引物：5'-GCTCTCAGCCTCGCCATA-3'；GAPDH，上游引物：5'-GTCAACGGATTTGGTCTGTATT-3'，下游引物：5'-AGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3'。反应条件为：95℃ 10min，95℃15s，60℃ 15s，共40个循环。以GAPDH 为内参，采用2-ΔΔCt法计算MNX1-AS1的相对表达量。

1.3随访:对所有患者术后进行电话、门诊等形式的定期随访，所有患者均随访5年，随访最终截止时间为2020年6月。随访结束后，生存70例例，死亡110例，无失访病例。其中无进展生存期(progression free survival,PFS)是指肿瘤确诊至发生疾病进展(肿瘤增长、病灶转移或发生新病灶)或死亡的时间；总生存期(overall survival,OS)为肿瘤确直至各种原因死亡时间或随访截止时间。

1.4统计学分析:采用SPSS21.0进行数据分析。计量资料采用表示，组间比较采用独立样本t检验；计数资料采用例(%)表示，并行χ2检验；采用Kaplan-Meier法进行生存分析并行Log-rank检验，采用Cox风险回归分析影响预后的因素。显著性水平α=0.05，P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1MNX1-AS1的表达:RT-qPCR检测NSCLC组织及癌旁组织中MNX1-AS1的表达结果显示，NSCLC组织中MNX1-AS1的相对表达量为(2.28±0.27)，显著高于癌旁组织的(1.08±0.24)，差异具有统计学意义(P<0.05)。见图1。

图1 NSCLC组织和癌旁组织中MNX1-AS1的表达

2.2MNX1-AS1的表达与NSCLC患者临床病理特征的关系:以NSCLC组织中MNX1-AS1表达水平的中位值(M=2.28)为截点，将180例NSCLC患者分为MNX1-AS1高表达组(≥2.28，n=90)和低表达组(<2.28，n=90)。进一步分析MNX1-AS1与NSCLC患者临床病理参数之间关系，结果发现，MNX1-AS1的表达与NSCLC患者的性别、年龄、肿瘤大小、病理类型等无关(P>0.05)，与肿瘤的分化程度、TNM分期及淋巴结转移显著相关(P<0.05)，见表1。

表1 MNX1-AS1表达与NSCLC患者临床特征的关系n(%)

2.3MNX1-AS1的表达与NSCLC预后的关系:所有患者随访5～60个月，中位随访时间为40个月。采用Kaplan-Meier法绘制NSCLC患者的PFS及OS生存曲线，结果发现，高表达组PFS为(26.44±15.61)个月，显著低于低表达组(34.87±15.95)个月，(t=3.580，P<0.001)；MNX1-AS1高表达组患者的OS为(34.29±17.16)个月，显著低于低表达组(40.54±15.05)个月(t=2.600，P=0.010)；本研究中MNX1-AS1高表达组患者的5年总生存率显著低于低表达组(26.7% vs 51.1%，χ2=11.052，P=0.001)，见图2。

图2 NSCLC患者的PFS和OS生存曲线

2.4影响NSCLC患者预后的多因素分析:将患者的临床病理参数及MNX1-AS1的表达均纳入多因素Cox回归分析，结果发现，TNM分期，淋巴结转移及MNX1-AS1的表达均为NSCLC患者预后OS的独立影响因素。其中MNX1-AS1高表达患者预后不良的风险是低表达者的1.545倍。见表2。

表2 NSCLC患者预后多因素分析

3 讨 论

NSCLC的发生发展是一个多基因参与的复杂过程，具有恶性程度高，易转移、复发及预后较差等特点[7]。因此从基因水平深入研究NSCLC发生发展的潜在分子机制对于NSCLC的早期诊断、治疗及预后判断十分重要。随着分子生物学技术的发展，越来越多的研究显示，多种lncRNA，如CCAT2、MALAT1、GAS6-AS1等在NSCLC组织中异常表达，可能是其潜在的新的治疗靶点[8]。MNX1-AS1位于人类7号染色体上，全长992bp。研究发现，MNX1-AS1在卵巢癌、宫颈癌、肝癌等多种恶性肿瘤中的表达异常升高，发挥癌基因的功能[9,10]。但目前关于MNX1-AS1在NSCLC组织中表达变化的报道较少，其与NSCLC疾病进展及预后的关系尚未明确。

研究发现MNX1-AS1在肺癌中显著上调，与TNM分期及淋巴结转移等病理特征密切相关，预示着不良预后[11]。本研究结果发现，MNX1-AS1在NSCLC组织中的相对表达水平显著高于癌旁组织，提示MNX1-AS1可能在NSCLC发生发展中发挥着致癌作用，与本课题组前期研究结果及其在乳腺癌、胃癌等恶性肿瘤组织中的表达趋势较为一致[12]。同时本研究结果还发现MNX1-AS1表达水平与NSCLC的分化程度、TNM分期及淋巴结转移密切相关，提示MXN1-AS1参与了NSCLC的发展及转移进程。进一步分析MNX1-AS1表达与预后的关系，发现MNX1-AS1高表达患者的PFS、OS及5年总生存率均显著低于低表达者，且MNX1-AS1表达水平是NSCLC患者的预后独立影响因素。上述结果充分说明MNX1-AS1与NSCLC的发生发展及预后密切相关，与Liu等[11]研究结果较为一致。

综上所述，MNX1-AS1在NSCLC组织中高表达，与肿瘤的分化程度、TNM分期、淋巴结转移及预后均相关，可作为NSCLC患者潜在的早期诊断及预后评估的生物学标志物。但MNX1-AS1在NSCLC发生发展及预后中的潜在分子机制上需要进一步的分子及临床研究进行验证。