人Carabin基因过表达的9型重组腺相关病毒的构建及功能鉴定

周殿儒，程阔菊，吴 庆，冯胜红，罗健华，黄 河，罗 云

(1.四川省达州市中西医结合医院药学部，四川 达州 635000 2.陆军军医大学第二附属医院麻醉科，重庆 400037)

carabin是Pan等研究学者于2007年发现的一个新的钙调磷酸酶(calcineurin,CaN))结合蛋白，主要表达于免疫细胞T和B细胞中，因同时可与calcineurin和Ras相互结合及作用，将其命名为carabin[1]。Pan等学者[1]的研究表明，carabin与CaN结合后可负反馈抑制CaN-NFAT通路，与Ras结合可特异性抑制Ras-ERK1/2通路。在人体免疫细胞T和B细胞活化过程中通过负反馈抑制CaN-NFAT通路和抑制Ras-ERK1/2通路阻断免疫细胞的持续活化，进而阻断免疫细胞持续活化而导致的过渡免疫，在机体免疫平衡中发挥着非常重要的作用[2～4]。进一步通过蛋白组学研究发现，carabin在人心肌细胞中亦有表达，并在小鼠心肌细胞中得到验证。通过小鼠carabin基因敲除证实，carabin蛋白可抑制小鼠冠状动脉左前降支部分结扎诱导的心肌细胞肥大[5]，并提出carabin有望成为临床在心衰方面诊治心肌肥厚的新靶点[6]。我们的前期研究也发现，carabin在缺血/缺氧诱导的人心室肌细胞株AC16及小鼠梗死心脏中表达均显著降低[7]，提示carabin可能会在心肌梗死方面起到一定作用，但目前尚无相关研究。鉴于此，本研究拟采用选择性噬心脏9型重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus type 9,rAAV9)，构建人carabin的9型重组腺相关病毒载体(rAAV9-carabin-IRES- ZsGreen)，通过感染人心室肌细胞株AC16，验证carabin蛋白过表达效果。为carabin蛋白在心肌梗死中的进一步研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1材 料

1.1.1细胞株及质粒:293 AAV 细胞株及腺相关病毒载体质粒(深圳百恩维生物科技有限公司)，pUC57- carabin质粒由本实验室提供。人心室肌AC16细胞株来源于美国模式培养物集存库( American type culture collection，ATCC)。

1.1.2主要试剂及仪器:DNA引物合成及测序(美国，invitrogen公司)，限制性内切酶EcoRI(NEB,#R0101M)、XhoI(NEB,#R0146M)，T4 DNA Ligase(NEB,M0202L)，胎牛血清FBS(invitrogen,C2027050)，高效转染试剂盒HET kit(深圳百恩维生物科技有限公司，BW11002)，Bio-Rad凝胶成像系统(Bio-Rad,SYSTEM GelDoc XR+ IM)。

1.2方 法

1.2.1pAAV9-carabin-IRES-ZsGreen载体构建:将质粒pUC57-carabin和pAAV9-IRES-ZsGreen在37℃水浴中进行EcoRI+XhoI双酶切。pAAV9-IRES-ZsGreen所得酶切大片段和pUC57-carabin质粒所得酶切目的基因在37℃T4DNA连接酶的作用下连接，所得连接产物在42℃水浴中化学转化至JM109感受态细胞中，取适量已转化的感受态细胞涂抹于含Amp+药液的LB平板上37℃培养过夜，次日于阳性平板上挑选单克隆菌落，接种于含Amp+药液的培养液中培养24h，提取JM109质粒、EcoRI和XhoI双酶切、DNA凝胶电泳鉴定目的基因阳性后，送invitrogen公司测序验证。

1.2.2rAAV9-carabin-IRES-ZsGreen腺相关病毒的包装、扩增及滴度测定:用高效转染试剂盒(HET Kit)将携带目的carabin基因的重组质粒pAAV9-carabin-IRES-ZsGreen导入293AAV细胞接种于10cm培养皿中，导入4-6h后更换新鲜的完全培养基，48h后收集上清液，剩余细胞于-80℃和37℃环境下反复冻融三次，高速离心后收集上清液，与之前上清液合并即为病毒原液。利用病毒原液感染293AAV细胞行连续三代病毒扩增，合并病毒液、纯化、浓缩。取20μL浓缩病毒液，提取病毒DNA，行Q-PCR检测病毒滴度。

1.2.3rAAV9-carabin-IRES-ZsGreen功能鉴定:取AC16细胞接种于细胞培养瓶中，当细胞融合至80-90%时加入1×105vg病毒液，孵育6-8h后更换培养液，48h后收集细胞提取蛋白，Western blot 检测carabin蛋白表达。

2 结 果

2.1pAAV9-carabin-IRES-ZsGreen载体的构建:DNAMAN分析pAAV9-carabin-IRES-ZsGreen质粒的中carabin基因序列与NCBI中提供的carabin序列一致(见图1)，表明pAAV9-carabin-IRES-ZsGreen载体构建成功。

图1 carabin基因的部分序列

2.2rAAV9-carabin-IRES-ZsGreen包装、收毒、扩增及滴度测定:将制备的重组质粒pAAV9-carabin-IRES-ZsGreen转染293AAV细胞后，换液48h后进行收毒。取病毒浓缩液提取病毒DNA，行Q-PCR检测病毒滴度，rAAV9-carabin-IRES-ZsGreen滴度为：5.09E+12 vg/mL。(见图2、3)。

图2 pAAV9-carabin-IRES-ZsGreen转染293 AAV细胞后48h(换液后)绿色荧光(左)与白光(右)对照图(×100)

图3 rAAV9-carabin-IRES-ZsGreen Q-PCR滴度检测A：标准品扩增曲线；B：rAAV9-carabin-IRES-ZsGreen扩增曲线；C：标准品标准曲线

2.3rAAV9-carabin-IRES-ZsGreen 功能鉴定:将构建成功的rAAV9-carabin-IRES-ZsGreen 感染人心室肌细胞株AC16，72h后提取总蛋白，western blot验证carabin过表达成功，结果见图4、5。

图4 rAAV9-carabin-IRES-ZsGreen转染AC16细胞后72h(换液后)绿色荧光(左)与白光(右)对照图

图5 rAAV9-carabin-IRES-ZsGreen 在人心室肌细胞株AC16内的过表达效应(+s,n=9)注：与正常组相比较，*P<0.05

3 讨 论

carabin是Pan等研究学者[1]于2007年新发现的一个钙调磷酸酶(calcineurin,CaN)结合蛋白，因同时可与calcineurin和Ras结合将其命名为carabin。经结合结构域鉴定，carabin蛋白CaN结合域位于羧基端，Ras结合域位于氨基端。CaN结合域的最小结合域为羧基末端(aa406-446)的41个氨基酸残基；Ras结合域的最小结合域为氨基端未端(aa89-294)的206个氨基酸残疾[1]。离体和在体实验的结合域功能鉴定表明：①CaN 结合域 ：carabin的核酸转录依赖于CaN- NFAT信号通路的活化，而后生成的carabin蛋白又通过其自身的CaN结合域结合CaN，反过来抑制CaN-NFAT信号通路，因此carabin是CaN-NFAT信号通路的负反馈抑制蛋白；②Ras结合域：carabin的氨基端具有Ras GAP活性，能特异性抑制Ras-ERK1/2信号通路。研究显示，在人体免疫细胞T和B细胞中，carabin 通过反负馈抑制CaN-NFAT信号通路和抑制Ras-ERK1/2信号通路阻断T细胞及B细胞的持续活化，从而避免免疫持续活化后对机体的伤害，以维持机体的免疫平衡状态[1～4]。经蛋白质谱鉴定，carabin在人、小鼠及大鼠心肌细胞中也有表达。并有研究显示，在小鼠心脏中，carabin可通过CaN-NFAT、Ras-ERK1/2及Ras- CaMKII信号通路抑制由冠状动脉左前降支部分结扎诱导的心肌肥大[5]。因此，在此基础上有学者提出carabin有望在心衰领域成为诊治心肌肥厚的新靶点[6]。

我们的早期研究发现，在小鼠心肌梗死动物模型中，carabin的mRNA和蛋白表达水平在术后第7天及14天的心脏梗死区域均显著下调(约7倍)；同时在缺血/缺氧诱导的人心室细胞株AC16中发现，carabin的mRNA和蛋白表达水平亦显著下调[7]。因此我们设想carabin可能会在心肌梗死中起到一定的作用，但目前尚无相关文献报道。 如前所述，carabin是一个新发现的蛋白，目前尚无特异性激动剂。鉴于此，本研究利用了对心肌细胞具有特异性选择的腺相关病毒rAAV9载体，插入人carabin基因，以此达到能选择性在心肌细胞中过表达carabin蛋白的作用，为进一步研究carabin在心脏中的作用奠定研究基础。

近年来，分子生物学技术的迅速发展推动着分子医学的不断进步，各种基因过表达及干扰手段不断成熟及简化。当前，用于基因干预的方法主要有质粒、慢病毒、逆转录病毒、腺病毒及腺相关病毒导入。腺相关病毒是近几年发展起来的新型基因导入载体，具有对所有哺乳类细胞感染的能力，并能在体内长期存在具有表达能力，且没有致病性，同时根据不同分型对不同细胞具有选择性[8]。根据其病毒衣壳的不同共有10余种血清型，每种血清型对不同的组织及细胞具有不同的亲和性，其中rAAV9对心脏具有高度亲和性，因此具有选择性感染心脏组织的能力[9,10]。因此，将目的基因构建进rAAV9病毒中，则可实现对心脏组织特异性过表达的目的，为后期在体实验研究carabin信号通路在心肌细胞中的作用奠定基础。

在rAAV9-carabin-IRES-ZsGreen构建过程中，我们首先将人carabin基因定向克隆至pAAV9-IRES-ZsGreen载体形成pAAV9-carabin-IRES-ZsGreen重组质粒 ，经测序验证后转染293 AAV 细胞，所合成病毒原液经反复扩增收毒、纯化及浓缩后测定病毒滴度，感染人心室肌细胞株AC16行rAAV9-carabin-IRES-ZsGreen功能鉴定，western blot验证carabin过表达成功，说明rAAV9-carabin-IRES-ZsGreen构建成功。rAAV9-carabin-IRES-ZsGreen的成功构建为后期carabin在心肌梗死及缺血中的作用机制研究奠定了实验基础。