姜明宇,任明永,高 莹,吴 楠,于忠莹
(哈尔滨医科大学附属第一医院儿科,黑龙江 哈尔滨 150001)
先天性脊柱裂的发病与机体的细胞过度凋亡存在着密切的关系[1]。骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)移植可以修复先天性脊柱裂多种组织发育异常,不仅可以修复各种神经元发育异常,而且也可以修复骨质发育异常。最新研究表明,在移植后的脊髓组织中发现大量存活的干细胞,并可转化为星形胶质细胞和神经元,弥补神经功能的巨大缺失[2]。STAT3 (signal transducer and activator of transcription 3)在神经胚胎发育过程中,细胞凋亡和细胞信号传导的调节以及干细胞的分化和转化过程中均发挥不可估量的作用。此外,STAT3在神经系统发育过程中的多个生理阶段,神经细胞的存活和损伤后修复的调节均有重要作用[3]。慢病毒为一种逆转录病毒,因其具有感染率高、可感染不分裂的细胞,整合表达稳定、对神经元具有高度亲嗜性等优势,可作为神经系统非常理想的载体[4]。本课题设计利用慢病毒-STAT3质粒标记骨髓间充质干细胞对显性脊柱裂大鼠在第16天进行胚胎期移植,观察STAT3过表达质粒转染对干细胞移植过程中神经分化的效果影响。为更好地服务于临床产前诊断,早期治疗小儿显性脊柱裂畸形奠定坚实的理论基础。
1.1显性脊椎裂畸形胎鼠模型的构建:将孕Wistar大鼠在受孕第10天(E10)给予4%维甲酸一次性胃管注射(135mg/kg),从而诱导显性脊柱裂动物模型。
1.2慢病毒STAT3过表达载体的构建:慢病毒STAT3过表达载体购自广州源井生物科技有限公司,选取pHBLV-U6-ZsGreen-PGK-Puro片段作为质粒的克隆载体。克隆切入点是XhoI/BamHI,编号为U06922。合成后经基因测序验证,进一步证实序列准确性。
1.3慢病毒细胞转染和实验分组:取生后10d Wistar大鼠股骨骨髓组织,在无菌条件下提取BMSCs,采用全骨髓贴壁法分离和纯化BMSCs。本研究采取第3代BMSCs,在6孔板中接种上述细胞,待融合率达到50%时开始慢病毒转染,慢病毒滴度维持在3×107(MOI=50),利用慢病毒作为载体将STAT3过表达质粒转染到BMSCs上 (MOI值300~500)。根据病毒转染情况分为如下三组:空白对照组,未转染慢病毒的BMSCs;阴性对照组,转染无序列质粒载体慢病毒的BMSCs;实验组,转染STAT3过表达载体慢病毒的BMSCs。
1.4骨髓间充质干细胞的鉴定:通过流式细胞检测法对CD34,CD45,CD73和CD90表面蛋白进行测定,为BMSCs的提取和鉴定提供科学依据。
1.5通过CCK-8试剂盒测定细胞活性:首先完善干细胞计数,在96孔4板中接种细胞,每孔细胞量维持不低于5×104个,同时设置2个复孔,37℃细胞培养箱中进一步孵育,选取在6,12,24,48和72h每孔加入10μL CCK-8溶液,检测波长在450nm时OD值。
1.6骨髓间充质干细胞移植治疗:在孕鼠第16天(E16)时,经10%水合氯醛300mg/kg腹腔麻醉后,三次腹壁清理及消毒后,依次经过腹壁,宫壁和羊膜囊,暴露胎鼠,计数宫内存活胎鼠数量及部位,在显微镜下分离胎鼠腰骶部。明确有无畸形后,经微量注射器迅速注射0.2μL未转染慢病毒的BMSCs(空白对照组)、转染无序列质粒载体慢病毒的BMSCs(阴性对照组)、转染STAT3过表达载体慢病毒的BMSCs(实验组)。迅速缝合宫壁、关闭腹腔,待孕鼠麻醉恢复正常后放回笼中继续观察。待饲养至20d时,根据分组,取出胎鼠脊髓组织。
1.7实时荧光定量PCR检测:加入RNA裂解液1mL,用无菌剪刀剪碎研磨,再次加入1mLRNA裂解液,注射器吹打成匀浆状。加入200μL氯仿充分混匀,13000rpm 4℃下离心15min。小心吸取上清,加入500μL异丙醇。4℃放置30min,13000rpm 4℃下离心15min。弃上清,沉淀物加入1000μL 70%酒精,漂洗一次。再次离心,吸取上清,沉淀物加入DEPC水20μL后制备成RNA样本并检测浓度和纯度。按照逆转录试剂反应说明书,配制反应体系。反应条件为:①95℃,0.5min,1个循环;②95℃,5sec;60℃,34sec,40个循环;③95℃,15sec;60℃,1min;95℃,15sec,1个循环。统计扩增结果并进行统计分析。Real Time-PCR Master Mix中的SYBR Green染料的荧光信号的强弱强度与双链DNA的数量相关,根据荧光信号的强弱检测出PCR体系存在的双链DNA数量。在60℃设置荧光检测点,以GAPDH作为内参照,结果以相对数值,即2-△△Ct表示。
1.8Western-blot检测:按照分组分别100mg脊髓组织加入1.5mLRIPA裂解液,组织匀浆机打碎组织,重复三次,均在冰上操作,每次约10sec。吸取上清液至EP管中,将EP管置于冰上裂解30min。然后将EP管于4℃下12000rpm离心15min,吸取上清至EP管中,即为提取的脊髓组织总蛋白。经过制胶、蛋白上样液、SDS-PAGE、封闭、洗膜、一抗和二抗孵育。将ECL试剂盒中的A、B试剂等体积混合后暗室曝光进行发光显影,Western Blot成像系统进行图像的采集。应用Image-J软件对条带进行扫描及灰度值分析。
2.1Wistar大鼠移植前骨髓间充质干细胞流式细胞鉴定结果:通过流式细胞技术检测4种表面标记物。结果表明:CD73和CD90表面标记物阳性,CD34和CD45标记物阴性(见图1)。其中,CD73和CD90为骨髓间充质干细胞表面纤维蛋白和核糖体受体,为非造血细胞起源。而CD34和CD45是内皮细胞和造血细胞的表面受体,提示Wistar大鼠骨髓间充质干细胞分离成功。
图1 流式细胞结果提示骨髓间充质干细胞分离成功
2.2CCK-8检测移植前各组细胞增殖活性:以4,8,12,16,20,24,48和72h为时间节点,检测空白对照组,阴性对照组和实验组移植前骨髓间充质干细胞的增殖活性。结果提示:三组活细胞量在时间节点无统计学差异(P>0.05)。提示慢病毒转染对骨髓间充质干细胞的增殖活性无显著影响,见图2。
图2 CCK-8细胞增殖曲线(移植前)
2.3CCK-8检测移植后各组细胞增殖活性:在移植后的第4天(E20)取出胎鼠脊髓,以4,8,12,16,20和24h为时间节点,对空白对照组,阴性对照组和实验组分别检测骨髓间充质干细胞的增殖活性,测定各组活细胞的OD值。结果提示:实验组在移植后的第8小时OD值最高,之后逐渐下降,与空白对照组和阴性对照组相比有统计学差异(P<0.05)。而空白对照组和阴性对照组检测后OD值高峰时间和峰值均无统计学差异,如图3所示。
图3 CCK-8细胞增殖曲线(移植后)
2.4移植后利用实时荧光定量PCR和Western-blot法检测各组脊髓组织中STAT3和pSTAT3的表达:经RT-PCR检测,与空白对照组和阴性对照组相比,在实验组中pSTAT3 mRNA的表达水平显著升高(P<0.05),而STAT3 mRNA表达水平显著降低(P<0.05),见表1。Western-blot法STAT3和pSTAT3相对蛋白表达趋势与实时荧光定量PCR结果一致,见表2和图4。
图4 Western-blot法检测各组脊髓组织中STAT3和pSTAT3的表达情况
表1 空白对照组阴性对照组和实验组STAT3 pSTAT3 mRNA表达水平比较
表2 空白对照组阴性对照组和和实验组STAT3 pSTAT3 蛋白表达水平比较
2.5实时荧光定量PCR和Western-blot法检测移植后各组脊髓组织中神经标志物GFAP,NSE,NF和Nestin的表达:见表3,空白对照组、阴性对照组和实验组三组GFAPmRNA相对表达量具有统计学差异。其中,在实验组中GFAP mRNA相对表达水平显著高于空白对照组和阴性对照组(P<0.05)。同时,NSE,NF和Nestin mRNA在各组中的相对表达趋势与GFAP基本一致。另外,GFAP,NSE,NF和Nestin蛋白表达趋势与实时荧光定量PCR结果完全相同,见表4和图5。
表3 空白对照组阴性对照组和实验组GFAP NSE NF和Nestin mRNA表达水平比较
表4 空白对照组阴性对照组和实验组GFAP NSE NF和Nestin 蛋白表达水平比较
图5 Western-blot法检测移植后各组脊髓组织中神经标志物GFAP,NSE,NF和Nestin的表达情况
2.6实时荧光定量PCR和Western-blot法检测移植后各组脊髓组织中凋亡信号分子Caspase-8和Bcl-2的表达量:从表5 RT-PCR的结果中,我们可以发现:Caspase-8和Bcl-2在实验组的相对表达水平要显著低于空白对照组和阴性对照组(P<0.05)。经Western-blot法进一步验证,结论与RT-PCR一致,见表6和图6。
表5 空白对照组阴性对照组和实验组Caspase-8 Bcl-2 mRNA表达水平比较
表6 空白对照组阴性对照组和实验组Caspase-8 Bcl-2蛋白表达水平比较
图6 Western-blot法检测移植后各组脊髓组织中凋亡信号分子Caspase-8和Bcl-2的表达量
信号传导与转录激活子-3(STAT3)来源于白介素-6(IL-6)作用于效应细胞后产生的急性期反应因子。多项研究表明STAT3可被众多细胞因子激活,如被活化的JAKs、IL-4和IL-12等[5]。在细胞内,STAT3呈无活性非磷酸化单体形式,一旦被细胞因子等特异性刺激后,即发生磷酸化,继而发生同源或异源二聚化转变,随后进入细胞核,与特异核酸序列结合,启动下游各种靶基因表达。我们在研究中尝试采用过表达技术,构建STAT3过表达质粒,结合慢病毒的高转染效率,稳固转染BMSCs,观察到经CCK-8检测,实验组在移植后的第8小时OD值达到峰值,细胞增殖活性较空白对照组和阴性对照组显著增强,提示STAT3过表达质粒转染可明显促进骨髓间充质干细胞和神经细胞之间转化。同时,从RT-PCR和Western-blot二个层面,pSTAT3在实验组中表达水平显著高于空白对照组和阴性对照组,而实验组中STAT3水平显著降低,提示STAT3在移植治疗过程中即发生磷酸化转变,启动下游各种靶基因的表达,促进BMSCs的转分化和神经细胞的增殖分化。
本研究还发现:实验组的GFAP mRNA相对表达量显著高于空白对照组和阴性对照组。NSE,NF和Nestin的mRNA各组相对表达量趋势与GFAP相同。另外,GFAP,NSE,NF和Nestin相对蛋白表达量趋势与实时荧光定量PCR结果完全相同。GFAP,NSE,NF和Nestin均来源于神经细胞表面的标识蛋白,胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)是星形胶质细胞活化后的表面标志物[6],维持细胞骨架的可塑性和张力强度;血清神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE)是一种特异性酸性蛋白酶,常见于多种神经内分泌细胞及神经元[7];神经丝蛋白(Neurofilament,NF)作为神经细胞轴突中间丝的重要组分,可稳固神经纤维的弹性,使伸展发生正常并防止中断。巢蛋白(Nestin)又被称为第Ⅵ类中间纤维,研究表明是胰腺干细胞和神经干细胞的表面标志蛋白,是中间纤维家族的重要成员。本研究从基因和蛋白两个水平,证实将慢病毒介导STAT3过表达质粒转染BMSCs,可以有效提高其向神经细胞的转化效率,使神经细胞的标记物(GFAP,NSE,NF和Nestin)相对表达量明显增高。STAT3通过JAK/ STAT途径与其他信号通路如MAPK途径的对话,参与神经调节细胞因子(neuroregulatory cytokine),白血病抑制因子(leukemia inhibtiory factor,LIF),睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor,CNTF) 等对神经前体细胞分化命运的调节,在此过程中STAT3抑制因子SOCS家族作为负反馈蛋白抑制JAK的活性。且STAT3在GFAP,NSE,NF和Nestin的启动子上有相应的结合位点,在特定因子的诱导下大脑皮层前体细胞分化为形成胶质细胞,启动GFAP,NSE,NF和Nestin基因的转录[8]。由此认为STAT3与神经细胞的分化密切相关。
神经管缺陷(neural tube defects,NTDs)是儿童相当常见的神经系统发育畸形,近年来逐渐增多,约占总出生人数0.1%-0.9%。神经沟中部或尾部闭合缺陷则引起脊柱裂[9]。最新研究表明,神经系统发育经历一系列复杂的生物学过程,涉及神经细胞和神经元的增殖、分化、凋亡、自噬,神经突触形成,信号传递和转导以及神经网络核团形成等。细胞凋亡作为生物细胞特殊形式的程序死亡,受周围组织多种效应细胞的参与和调控,因此对生命活动的多个过程,如胚胎组织的早期发育、器官组织的形态发生以及效应器官的功能形成等均发挥巨大的调控作用。一旦细胞凋亡过度,则可引起体内相应神经细胞和脊髓组织受损,形成临床上常见的脊柱裂畸形[10]。骨髓间充质干细胞具有自我更新和多向分化潜能等生物学特点,在特定的理化环境和细胞因子诱导下能够转化为多种细胞类型。最近研究表明,骨髓间充质干细胞可以分化为神经胶质细胞,神经元,肌细胞以及成骨、破骨细胞等[11]。因此,BMSCs是组织工程一种比较理想的种子细胞来源,干细胞移植治疗先天性脊椎裂有望成为治疗先天神经发育畸形最有前途的方法之一。本研究中,从基因蛋白两个水平,移植后实验组caspase-8和Bcl-2表达水平明显低于空白对照组和阴性对照组,提示STAT3过表达质粒转染BMSCs可以显著抑制脊柱裂发病的凋亡进程,通过Caspase-8和Bcl-2两个重要凋亡分子作用发挥抗凋亡效应。研究表明[12]:STAT3参与神经系统发育过程中神经细胞的分化,JAK/STAT信号转导途径是能够决定细胞分化的一个重要机制,调控着相关基因的表达。在神经系统的发育过程中,STAT3与其他信号途径协同调节体内神经前体细胞的分化命运,STAT3结合元件的甲基化状态还决定了细胞的分化潜能。STAT3与神经干细胞的增殖密切相关,在成熟的神经细胞或胶质细胞中均高度表达,提示STAT3对神经上皮细胞早期的分化起重要调控作用。
综上所述,构建STAT3过表达质粒通过慢病毒介导的方法转染骨髓间充质干细胞,可以提高其向神经细胞转化的效率,为先天性脊柱裂的治疗提供新的种子细胞。