环孢素A治疗复发性流产的研究进展

葛梦迪，赵小萱，赵颜，冯晓玲

复发性流产（recurrent spontaneous abortion，RSA）是妇产科常见疑难症之一，严重威胁育龄期女性的身心健康。近年来，其发病率逐渐升高，其规范性治疗是亟需解决的重要问题。目前治疗主要是对因治疗，部分原因不明的RSA属于免疫因素[1]，免疫治疗也得到了广泛关注。环孢素A（cyclosporine A，CsA）是一种大环内酯类免疫抑制剂，因其促进母胎免疫耐受和滋养细胞的生物学功能，近年来被应用于生殖领域，这可能对RSA的治疗来说是一个新的方向和线索。现对近年CsA治疗RSA的作用机制和联合中药治疗的研究进展进行综述，以期为提高临床疗效提供新的理论支持。

1 RSA的定义及病因分析

根据自然流产诊治中国专家共识（2020年版），基于中国的基本国情及目前临床实践研究建议将连续发生自然流产2次及2次以上，在妊娠28周之前的胎儿丢失定义为RSA，包括连续发生的生化妊娠。强调流产的连续性和重视流产的再发风险[1]。RSA的发生率约为1%，最高可达患者总数的5%[2]。RSA的病因包含免疫学、易栓、感染、男性因素、染色体、解剖、内分泌异常及其他不良生活方式、不良环境暴露等因素。全面科学严谨地排除所有病因后，仍有一部分因素尚未被科学阐释，称为不明原因的复发性流产（unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA）。近年来，与RSA有关的免疫因素备受关注。免疫学病因主要分为自身免疫和同种免疫。目前自身免疫因素主要涉及的疾病有抗磷脂综合征（antiphospholipid syndrome，APS）、系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）等[3]。同种免疫则与母胎免疫耐受相关免疫活性因子[包括自然杀伤（natural killer，NK）细胞、巨噬细胞、T细胞等]与蜕膜以及滋养细胞等之间的信息交流障碍而导致的母胎免疫耐受失衡相关[4]。许多证据表明URSA的发病与母胎免疫耐受失衡有关，因此，URSA也可以称为同种免疫型RSA[1]。

2 CsA概述

CsA是一种最初从土壤真菌中分离出来的11种氨基酸亲脂性环形多肽。Calne是最早将CsA作为免疫抑制剂应用的学者，他通过动物实验和人体试验发现CsA能有效预防器官移植的排斥反应，并对于一些自身免疫性疾病的治疗有较高价值[5]。CsA可以通过抑制钙调神经磷酸酶而抑制T细胞增殖和发育，从而达到免疫抑制的作用[6]，因此其广泛应用于多个领域，如肾移植、动静脉瘘成熟和糖尿病视网膜炎症等[6-8]。CsA不仅可以抑制T细胞活化，也可以直接调节包括树突状细胞、巨噬细胞和中性粒细胞在内的先天免疫细胞介导的反应[9]。2000年，有国外研究证实CsA在器官移植后妇女妊娠中可安全使用[10]。2002年，李大金教授团队通过观察CsA对人妊娠早期滋养细胞的作用，发现适宜剂量（1×10-4～1 μmol/L）的CsA可促进滋养细胞的生长、运动[11]。之后李大金教授团队的后续临床研究提出，CsA通过改变滋养细胞titin的生物学行为利于胚胎顺利着床[12]。有研究表明接受器官移植的妊娠患者在接受免疫抑制剂（包含CsA）治疗的前提下，约70%生育了健康的后代，先天性畸形或新生儿并发症的患病风险并未增加，这表明CsA在妊娠期间可以安全使用[13]。另外，接受CsA治疗的移植后母亲在母乳喂养时，初乳中CsA及其代谢产物含量是较低的[14]。此结论与意大利的一项研究相符合[15]，该研究认为CsA对于母乳喂养的新生儿的不良事件几乎没有发生，且呈现小概率事件，但是考虑到可能对新生儿产生免疫抑制效应，不建议CsA治疗期间母乳喂养。并且认为CsA可以在整个妊娠过程中安全服用，且为有活动性自身免疫性疾病的孕妇提供了一种药物选择。

3 CsA对母胎免疫耐受细胞因子平衡的调节

妊娠是向母体免疫系统发起挑战的一个过程，胎儿作为一个半异体的存在，需要享受母体免疫系统的特权，使胎儿能够被母体接受，避免对异基因胎儿的有害免疫反应，同时还需要保护母亲和其未来胎儿免受病原体的入侵。因此母胎免疫耐受对于成功妊娠不可或缺，当然也与免疫耐受相关联的细胞因子的平衡密不可分。

3.1 CsA降低辅助性T细胞1型（Th1）/Th2的比值Th2免疫能够促进同种异体母婴免疫耐受，普遍认为成功妊娠需要Th2占优势，若是Th1免疫在母胎界面占优势时则可能导致妊娠失败，因此两者之间的平衡对于妊娠是有积极意义的[16]。有学者研究CsA对于Th1/Th2比值升高的RSA患者的治疗效果发现，分别作为Th1和Th2转录前体的T-bet和GATA-3因子发生了变化，前者表达下降，后者表达增加；Th1细胞数以及相关细胞因子的基因水平降低，而Th2则升高；CsA治疗组的活产率达81.5%，而对照组只有42.1%，差异有统计学意义（P＝0.000 1）。因此推测CsA作为免疫抑制剂，能够使Th2型反应和细胞因子分泌转变，导致Th1/Th2比例降低，从而改善妊娠结局[17]。这与Zheng等[18]的研究相一致。CsA对于Th1主要相关的细胞因子γ干扰素（interferon-γ，IFN-γ）、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的生成有抑制作用。另外，CsA可以使RSA患者外周血中Th1浸润和Th1/Th2比值降低，同样可以改善肥胖患者的脂肪积累和胰岛素抵抗现象[19]。这提示CsA对那些肥胖且胰岛素敏感性降低的RSA患者也是一个不错的选择，但尚需大量临床研究验证其可行性。另外，树突状细胞可通过产生CC趋化因子配体2（CC motif ligand 2，CCL2）和白细胞介素33（interleukin-33，IL-33）而导致母胎界面Th2偏移[4]。而有研究表明树突状细胞可能是CsA的潜在靶点，CsA可以调节树突状细胞产生细胞因子[9]。

3.2 CsA对Th17/调 节 性T细 胞（regulatory T cells，Tregs）平衡的调节Th17作为Th细胞的一个子集，对于妊娠所需的抗炎环境具有不利影响。Tregs具有维持免疫耐受的免疫抑制特性，主要通过识别共同刺激分子的细胞接触依赖机制和分泌对免疫应答进行负性调节的细胞因子[包含转化生长因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）和IL-10]来发挥作用的[20]。因此，Tregs和Th17之间的平衡对于维持妊娠非常重要，若是失衡则会导致妊娠相关疾病的发生，如妊娠期糖尿病[21]、RSA[22]和子痫前期[23]。最近一项研究发现，CsA可降低Th17主要效应因子IL-17A的产生，上调RSA孕妇外周血Tregs相关因子TGF-β1、IL-10以及抑制性共激活因子细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4（cytotoxic T lymphocyte associated protein 4，CTLA-4）和T细胞免疫球蛋白黏蛋白3（T cell immunoglobin mucin-3，Tim-3）的表达，促进Tregs优势[22]。这些结果提示，CsA作为滋养细胞功能启动子恢复了Th17/Tregs的平衡。CsA是否对其他的Th17细胞因子也有调节作用以及相应的作用机制，尚需大量的实验研究继续发掘。

4 CsA对滋养细胞的影响

滋养细胞对于妊娠至关重要，在胚胎着床、母胎相互作用以及子宫螺旋动脉重塑方面发挥着必不可少的作用。滋养细胞的正常增殖、进一步分化以及侵袭力对于妊娠状态中的母体与胎儿非常重要。若其功能发生障碍，会引起一系列的疾病，例如滋养细胞肿瘤、流产、子痫前期和胎儿生长受限等。先前研究表明CsA对于滋养细胞的功能有一定的优势作用[11]。

4.1 CsA与滋养细胞氧化应激正常的妊娠建立需要滋养细胞功能的正常运作，同时维持氧化平衡也很重要。健康女性正常妊娠时，胎盘会产生并维持较低水平的活性氧[24]，如果发生氧化应激活性氧产生过多，会损伤滋养细胞的功能，导致妊娠失败和妊娠并发症。Tang等[25]为了探究CsA对滋养细胞氧化应激的作用和机制，用过氧化氢（H2O2）诱导人绒毛膜癌细胞（JEG-3）的氧化应激状态，同时加入CsA共培养，结果显示CsA可以提高人绒毛膜癌细胞（JEG-3）的存活率并且能够减轻H2O2诱导的形态学损伤，可能是通过FAK/Src信号通路起到对人绒毛膜癌细胞（JEG-3）氧化损伤的保护作用。张瑾等[26]的研究也发现CsA具有缓解滋养细胞氧化应激损伤的作用，但是该研究加用了山奈酚，且认为与细胞核内Nrf2蛋白的上调有关。由此可见，CsA对滋养细胞免疫损伤的保护作用可以通过多个机制来实现。

4.2 CsA增强滋养细胞的增殖及侵袭力胚胎着床离不开滋养细胞的增殖、侵袭潜能以及与子宫内膜之间的信息交流。整合素和层粘连蛋白在滋养细胞和子宫内膜上的表达是胚胎着床过程中的关键步骤。Huang等[27]分别在0.1～10 μmol/L CsA的浓度下处理小鼠的囊胚，发现囊胚形成率、囊胚细胞数未发生改变，也未影响囊胚细胞的凋亡；而在0.1 μmol/L和1 μmol/L CsA组的囊胚黏附率显著高于对照组；另外1 μmol/L CsA可显著增强囊胚拉伸，提示CsA可能促进囊胚滋养细胞的侵袭。基质金属蛋白酶9（matrix metalloproteinases-9，MMP-9）是分解细胞外基质的主要蛋白水解酶，使胚泡植入，另外，蛋白水解酶的表达反映了滋养细胞的侵袭程度[6]，整合素β3（integrin β3，ITGβ3）则在黏附中起作用，1 μmol/L CsA明显在基因和蛋白水平促进了ITGβ3和MMP-9的增加，由此可见，CsA对成功妊娠是有积极意义的，不仅可以促进胚胎着床，还促进了胚胎滋养细胞的侵袭性生长。这在Huang等[28]的研究中也得到了证实，他们发现1 μmol/L CsA可以促进MMP-9的表达，并且该浓度下细胞增殖最强，S期细胞数增加最多。同时该研究团队还发现TRAIL可能是CsA调控绒毛外滋养细胞（extravillous trophoblast，EVT）增殖和侵袭及迁移的靶基因，而TRAIL基因在胎盘EVT中呈高水平表达[29]。然而在RSA的患者中同样也证明了这一观点。田红菊等[30]将60例RSA患者分为2组，观察组口服CsA（50 mg，每8 h 1次）和地屈孕酮（10 mg，每8 h 1次），对照组口服地屈孕酮（10 mg，每8 h 1次），均连续服用30～40 d，自确定妊娠即尽早口服。观察人绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，hCG）、孕酮（progesterone，P）和雌二醇（estradiol，E2）的变化，发现观察组妊娠早期hCG、E2水平明显高于对照组，且观察组保胎成功率达90%，对照组为66.67%，差异有统计学意义（P＜0.05）。提出CsA通过提高滋养细胞的增殖和侵袭力来提高URSA的保胎成功率。

4.3 CsA减少滋养细胞的凋亡细胞凋亡与母胎耐受关系密切，不受控制的滋养细胞凋亡与妊娠的一些并发症有关。氧化应激是诱导滋养细胞凋亡的因素之一[31-32]。无论是健康还是病态胎盘在形成过程中，胎盘和滋养细胞的数量和类型都是由细胞凋亡调控的，因此，细胞凋亡如果出现失控或者异常，会导致妊娠不良结局。He等[31]发现用CsA（1 μmol/L）处理H2O2诱导的氧化应激的JEG-3细胞，可以减轻细胞核固缩和碎裂，减少凋亡相关基因p53、JNK和p38的激活，降低促凋亡因子BAX的表达，促进半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase-3）的表达，从而裂解细胞底物多腺苷二磷酸核糖聚合酶[poly（ADPribose）polymerase，PARP]，并增加抗凋亡蛋白B细胞淋巴瘤2（Bcl-2）表达。由此推测，CsA可以通过抑制p53和JNK/p38信号通路的激活进而减少滋养细胞受氧化应激诱导的凋亡。徐秋霞等[32]也发现CsA可以使自噬标志蛋白LC3Ⅱ表达增加，从而抑制滋养细胞凋亡。然而Huang等[27]分别在0.1～10 μmol/L CsA的浓度下处理小鼠的囊胚，其囊胚细胞的凋亡并未发生改变。这可能与实验材料与实验流程有关，而He等[31]使用的JEG-3细胞更能模拟真实人体情况，相比于小鼠实验更具说服力。同样在Tai等[33]的研究中，丹参酮ⅡA联合CsA在肾缺血再灌注所致心肌损伤中，通过激活磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B/Bcl-2关联死亡启动子重组蛋白（phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B/recombinant Bcl-2 associated death promoter，PI3K/Akt/Bad）途径来保护心肌线粒体功能，从而抑制心肌细胞凋亡。综上，CsA抑制细胞凋亡的作用机制在其他学科也得到了证实，但因有少数不同结论的报道，CsA减少滋养细胞凋亡的作用机制仍然需要进一步研究，以期为免疫型RSA患者提供另一条治疗思路。

5 CsA联合中药治疗RSA

五味子是临床常用的中草药，其提取物五味子乙素B（Schisandrin B，Sch B）可以通过抑制氧化应激、细胞凋亡和自噬来抑制活性氧（reactive oxygen species，ROS）的积聚，从而减轻大剂量CsA用药所致的肾毒性[34]。这对于器官移植后需要大量CsA治疗的患者来说是一种选择。杨春燕[35]将URSA患者分为治疗组（43例，给予补肾安胎方联合CsA）和对照组（38例，单纯使用CsA），结果显示2组hCG和E2水平均较治疗前显著升高，且中药组疗效更显著，推测CsA可以通过抑制CD4细胞的功能，改善母体免疫抑制，维持正常妊娠，该研究随后随访新生儿发育未发现异常。由此可见，CsA对于URSA患者可能是一个新的选择，鉴于可能的不良反应，可以考虑联合中药给予患者更好的治疗。

6 结语与展望

CsA可以降低Th1/Th2的比值、调节Tregs和Th17之间的平衡进而调节母胎免疫耐受，也可提高滋养细胞增殖及侵袭力，减少滋养细胞受氧化应激的损伤以及凋亡，顺应妊娠时需要的免疫环境，提高妊娠成功率，对于免疫型RSA患者的治疗是一个不错的选择。虽然目前大多数研究均证实CsA可以在妊娠期使用且较少发生不良事件，但其用药安全性、对后代生长发育的影响仍需继续研究。同时，亟需高质量的大样本随机双盲对照试验和基础研究进一步探索CsA治疗RSA的作用机制以及与其他药物的相互作用，进而明确最安全的给药时间、剂量以及用药周期，明确禁忌证及适应证，制定规范化治疗标准，进一步增加CsA在临床的可用性。