环状RNA在多囊卵巢综合征发生发展中的作用

皇灵俐，冯睿芝，钱云

多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是育龄妇女无排卵性不孕的常见病因，在世界范围内患病率约5%～20%[1]。PCOS是以无排卵或稀发排卵、高雄激素和卵巢多囊样改变为特征的异质性综合征，PCOS患者罹患不孕、胰岛素抵抗和2型糖尿病、心血管疾病和子宫内膜癌等疾病的风险增加。虽然PCOS的病因仍未完全明确，但研究认为PCOS是多因素致病，其中遗传因素在其发生发展中起关键作用[2]。环状RNA（circular RNA，circRNA）是由真核生物的前体mRNA反向剪接产生的，具有细胞特异性和组织特异性。circRNA的产生依靠剪接体机制，且受顺式作用元件和反式作用因子的调节[3]。随着RNA测序技术和新型生物信息化方法的发展，最新的一些研究已在卵巢和胎盘等多种组织中检测并鉴定出了丰富多样的circRNA[4-5]，相关研究发现差异表达的circRNA在PCOS的发生发展中发挥重要作用[6-7]，这促进了PCOS与circRNA关系的研究。关于circRNA与PCOS发生发展机制的研究仍处于初步阶段，现就目前circRNA在PCOS发病中可能的作用进行综述。

1 circRNA概述

circRNA是通过特殊的选择性反向剪接方式产生的，即外显子的3′端通过3′，5′-磷酸二酯键与其自身的5′端或上游外显子连接，形成具有反向剪接连接位点的封闭环[8]。circRNA形成的剪接方式主要有2种：套索模型和直接反向剪接模型[9-10]。在套索模型中，反向剪接的外显子跳跃形成内含子套索，内含子进一步反向剪接形成circRNA。在直接反向剪接模型中，前体mRNA直接发生反向剪接形成circRNA。研究表明由外显子形成的circRNA通常定位于细胞质[11]，少数外显子circRNA定位于细胞核，且细胞核内circRNA的作用主要是为染色质招募蛋白质[12]。Li等[13]发现某些含有内含子的circRNA定位于细胞核内，主要调节其亲本基因表达。细胞外间隙中的外泌体中也发现circRNA的存在[14]，外泌体中的circRNA异常表达在疾病的发生发展中起着重要作用，胃癌中的circRNA可以通过外泌体转移到受体细胞中，表明外泌体circRNA在胃癌的侵袭和转移中起重要作用[15]。circRNA的表达水平一般较低，且具有细胞特异性和组织特异性[16]。Rybak-Wolf等[17]观察到circRNA在哺乳动物的大脑中显著富集。Conn等[18]发现circRNA在人类上皮-间质转化等某些生物过程中也显著富集。

虽然circRNA的表达量普遍较低，但circRNA可在分子水平上通过不同的作用方式在生理和病理条件下发挥潜在的重要作用。circRNA的生物功能：①circRNA通过形成RNA-DNA杂交体与宿主基因的合成位点结合，导致转录暂停或终止，从而上调外显子跳跃或截短的转录本水平。②外显子-内含子circRNA与U1小核核糖核蛋白（small nuclear ribonucleoprotein particles，snRNP）结合，然后与DNA聚合酶Ⅱ相互作用，增强亲本基因的表达。③circRNA可作为竞争性内源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）通过微小RNA（microRNA，miRNA）的反应元件与miRNA竞争性结合，间接调节miRNA靶向mRNA的表达。④circRNA可以与蛋白质相互作用。⑤含有内部核糖体进入位点（internal ribosome entry site，IRES）的circRNA可以直接招募核糖体并被翻译。⑥YTH结构域家族蛋白3（YTH domain family protein 3，YTHDF3）可以识别含有N6-甲基腺嘌呤（N6-Methyladenosine，m6A）的circRNA，YTHDF3招募真核翻译起始因子4G2（eukaryotic initiation factor 4G2，eIF4G2），从而触发翻译。这一过程可被甲基转移 酶 样3/14（methyltransferase like protein 3/14，Mettl3/14）增强，被脂肪量和肥胖相关蛋白（fat mass and obesity-associated，FTO）抑制[8]。见图1[8]。

图1 circRNA生物学功能[8]

2 circRNA在PCOS患者中的差异表达

高通量测序和基因芯片的迅速发展推动了对circRNA在PCOS发病机制中的研究。为了研究circRNA的潜在作用，Wang等[19]对PCOS患者卵泡液外泌体中的RNA进行了circRNA测序，共鉴定出167个上调和245个下调的circRNA，进一步的功能分析表明，PCOS患者与细菌感染、慢性炎症和氧化应激相关的通路可能受不同的circRNA调节。Huang等[20]也研究了PCOS患者卵泡液外泌体中差异表达的circRNA，发现16个circRNA的表达具有显著差异，并证实了其中的hsa_circ_0006877（circLDLR）对颗粒细胞的增殖、凋亡以及激素分泌均有影响。

更多学者对颗粒细胞中circRNA的表达谱进行了研究。Che等[21]检测了PCOS患者卵丘颗粒细胞中circRNA的表达谱，共鉴定出1 032个差异表达的circRNA，其中311个表达上调，721个表达下调。该研究采用实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）方法对测序结果中表达下调的4个circRNA（包括hsa_circ_0083952、hsa_cic_0082709、hsa_circ_0002425和hsa_circ_0015168）进行了验证，结果显示这4种circRNA在PCOS患者颗粒细胞中表达下调。Ma等[4]收集6例PCOS患者和6例因输卵管因素等器质性病变行辅助生殖技术患者（对照组）的颗粒细胞进行circRNA基因芯片分析，结果鉴定出286个差异表达的circRNA（上调167个，下调119个），经qRT-PCR验证，PCOS组hsa_circ_0043533和hsa_circ_0043532的 表 达 水平显著升高，hsa_circ_0097636的表达水平显著降低；而Zhang等[22]在15例PCOS患者颗粒细胞中发现4个circRNA上调，23个下调，后续qRT-PCR证实PCOS患者中hsa_circ_0001577基因表达上调，hsa_circ_0020093基因表达下调，提示这些circRNA参与了PCOS的发生发展，可能作为PCOS潜在生物标志物。

另有学者认为，PCOS孕妇的病理生理可能会导致胎儿表观遗传在子宫的重新编程，从而导致其后代生殖功能的异常[23]。Zhao等[5]发现，与正常产妇相比，PCOS患者的胎盘胎儿面组织中的circRNA有14个显著上调，101个显著下调。

3 circRNA异常表达在PCOS发病机制中的研究

3.1 circLDLR雄激素的产生受细胞色素P450家族19亚 家 族A成 员1（cytochrome P450 family 19 subfamily A member 1，CYP19A1）基因表达的调节，CYP19A1编码细胞色素P450芳香化酶。在卵巢中，芳香化酶负责将雄激素转化为雌激素，其在PCOS卵母细胞发育障碍中发挥重要作用[24]。研究证明，在PCOS患者的卵巢组织中，CYP19A1的表达水平较低，卵巢芳香化酶活性和雌二醇产生减少[25]。

已有研究表明，circRNA通过与CYP19A1的相互作用在PCOS的发病机制中发挥重要作用。Huang等[20]比较了PCOS患者和因输卵管因素等器质性病变行辅助生殖技术助孕患者（对照组）卵泡液外泌体中的circRNA表达谱，结果显示16个circRNA表达差异显著，其中下调的circLDLR是从其亲本低密度脂蛋白受体（low density lipoprotein receptor，LDLR）基因加工而来，该基因参与了卵巢类固醇合成调节。该研究通过Cytoscape软件预测了circLDLR-miR-1294-CYP19A1 ceRNA网络，并通过荧光素酶实验证实了circLDLR是miR-1294的分子海绵。人卵巢颗粒细胞瘤KGN细胞过表达circLDLR伴随着miR-1294的下调、CYP19A1蛋白表达上调和雌二醇分泌增加；circLDLR水平下调导致miR-1294上调、CYP19A1蛋白表达下调以及雌二醇分泌减少。同时，转染miR-1294类似物可以挽救KGN细胞外泌体中circLDLR的下调对CYP19A1表达和活性的影响。基于芳香化酶在雄激素转化为雌二醇过程中发挥重要作用，circLDLR基因的异常表达可能是PCOS患者高雄激素血症的重要发病机制之一。

可见，卵泡液中外泌体circRNA的变化可能是导致PCOS发生的重要原因，circLDLR通过海绵吸附miR-1294抑制CYP19A1而发挥调节雌二醇分泌的作用，参与了卵巢类固醇激素的合成，为进一步治疗PCOS提供新的靶点和策略。

3.2 hsa_circ_0118530颗粒细胞的增殖分泌功能与卵母细胞的生长发育密不可分。颗粒细胞的异常增殖和凋亡影响卵泡成熟，PCOS患者卵泡发育不成熟则影响排卵，从而导致不孕[26]。Ma等[4]在PCOS患者卵丘颗粒细胞中发现并鉴定出了一种新的表达增加的circRNA，即hsa_circ_0118530。Jia等[6]进一步对hsa_circ_0118530在PCOS发病机制中的作用进行了分子研究，用hsa_circ_0118530小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）转染KGN细胞，结果显示KGN细胞活力下调，细胞凋亡增加，细胞迁移显著受到抑制；通过生物信息学分析和双荧光素酶报告实验验证并确定了hsa_circ_0118530与miR-136之间的相关性，在KGN细胞中抑制miR-136可逆转hsa_circ_0118530 siRNA对细胞生长的影响。但miR-136对PCOS发病机制的具体作用机制有待进一步研究。可见，hsa_circ_0118530通过调节miR-136促进PCOS的发生，为PCOS提供了一个新的治疗靶点。然而，其是否可以直接或间接地影响卵巢功能，还需要进行深入的研究。

3.3 circASPHcircASPH起源于第4～14外显子的天冬氨酸β-羟化酶（aspartate-β-hydroxylase，ASPH）基因的环化，在肺腺癌中最早被研究[27]，并且受到高迁移率族蛋白A2（high-mobility group A2，HMGA2）的调控；circASPH促进了肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭。Wu等[7]以KGN细胞为模型研究circASPH在PCOS中的潜在作用，发现过表达circASPH后KGN细胞的活力增加、凋亡降低，而敲低circASPH后KGN细胞的凋亡率明显升高。同时，circASPH过表达显著降低KGN细胞内活化的多腺苷二磷酸核糖聚合酶（poly ADP-ribose polymerase，PARP）和活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase 3）的蛋白水平，而敲低circASPH使活化的PARP和caspase 3蛋白的水平显著增加。该研究证实miR-375是circASPH的靶点，补充miR-375类似物可以挽救KGN细胞中circASPH的下调引起的增殖抑制。该研究还发现，miR-375的下游靶基因是重组人丝裂原激活蛋白激酶激酶6（mitogen-activated protein kinase kinase 6，MAP2K6），在KGN细胞中与circASPH通过海绵吸附miR-375调节MAP2K6的表达。可见，circASPH在PCOS中起致病作 用，PCOS中 存 在circASPH/miR-375/MAP2K6的ceRNA网络，这对PCOS的临床诊断和治疗具有重要意义。

3.4 circPUM1Deng等[28]推测miR-760可能参与了PCOS的进展，进一步研究表明miR-760在KGN细胞中表达降低；miR-760下调促进KGN细胞的增殖，抑制其凋亡。该研究应用生物信息学分析、RNA结合蛋白免疫沉淀法、双荧光素酶报告实验和RNA下拉实验等证明，circPUM1对miR-760有海绵作用。该研究还发现circPUM1的过表达促进细胞的增殖，抑制细胞凋亡，而miR-760的过表达可以逆转circPUM1下调对KGN细胞的生物学效应。可见，circPUM1通过海绵吸附miR-760并负调控其表达，调节颗粒细胞的功能，揭示了特定的circRNA在PCOS进展中的作用，为PCOS分子机制研究提供了新的思路，并为PCOS的治疗提供了潜在的治疗靶点。

4 结语

PCOS的发病机制尚不明确，circRNA为探索PCOS的病因提供了一个很好的思路。circRNA可通过吸附miRNA在转录后水平调节相应靶基因的表达，参与PCOS类固醇的产生、颗粒细胞增殖与凋亡，继而影响卵泡发育。目前对circRNA的生物发生和功能的理解已取得一定进展，但关于circRNA在PCOS中的研究仍处于初步阶段，circRNA在PCOS发病中的具体作用机制仍需要更多的科学研究来验证。目前研究表明circRNA的异常表达在PCOS的发生、发展中起着重要作用。深入诠释circRNA的生物发生和调控会加深对RNA功能及其与PCOS关系的理解。深入对circRNA的研究有助于了解PCOS的发病机制，为PCOS未来研究方向提供新思路，更为PCOS患者个体化治疗及长期管理提供更好的理论基础。