枳实薤白桂枝汤对不稳定性心绞痛患者血清基质金属蛋白酶-9水平及其基因表达的影响

朱德建 朱志仑 吴溧兴 陆 曙

(江苏省南京市溧水区中医院心血管科，江苏 南京 211200)

不稳定性心绞痛(unstable angina，UA)是急性冠状动脉综合征(acute coronary syndrome，ACS)的一种常见类型，主要发病机制为不稳定斑块破裂。而动脉粥样硬化斑块纤维帽的破裂是由细胞外基质(ECM)合成与分解的动态平衡失调造成的。ECM由胶原、糖蛋白和蛋白聚糖等物质构成。基质金属蛋白酶(MMPs)具有水解弹性蛋白和明胶的能力，能够破坏ECM的网状结构，促进斑块裂解[1]。MMP-9是MMPs家族中分子量最大的明胶酶，是造成易损斑块破裂的主要降解酶之一。不稳定斑块易于破裂的侧部(也称肩区)聚集大量的巨噬细胞、泡沫细胞，MMP-9表达明显增加[2]。ACS患者冠状动脉循环血浆及外周血清中MMP-9水平升高，且明显高于稳定型心绞痛患者,并与冠状动脉狭窄程度有相关性[3-5]。在新生血管的病变斑块中，MMP-9的表达显著增强，颈动脉粥样硬化斑块中MMP-9的水平与斑块的易损性及颈动脉闭塞呈正相关[6]。易损斑块中新形成血管的脆性高，ECM的稳定性极差，且新生的毛细血管易撕裂，触发斑块破裂，导致ACS。以上众多研究提示，MMP-9可作为反映动脉粥样硬化斑块不稳定的标志物。2018年我们采用枳实薤白桂枝汤治疗寒凝、痰浊、血瘀、气滞证素UA患者32例，并与西医标准治疗30例对照，观察对血清MMP-9水平及其基因表达的影响，结果如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择南京中医药大学无锡附属医院心血管科UA住院患者62例，按照随机数字表法分为2组。治疗组32例，男19例，女13例；年龄41～76岁，平均(62.88±7.97)岁；病程1～29年，平均(8.74±1.62)年；Braunwald心绞痛分级[7]：ⅠA级3例，ⅠB级8例，ⅡA级5例，ⅡB级12例，ⅢA级1例，ⅢB级3例；危险分层[7]：低危9例，中危19例，高危4例；合并症：原发性高血压21例，2型糖尿病10例，高脂血症7例，肥胖8例；吸烟7例。对照组30例，男16例，女14例；年龄38～79岁，平均(62.90±7.94)岁；病程3～32年，平均(9.02±1.76)年；Braunwald心绞痛分级：ⅠA级3例，ⅠB级5例，ⅡA级7例，ⅡB级11例，ⅢA级2例，ⅢB级2例；危险分层[7]：低危10例，中危16例，高危4例；合并症：原发性高血压23例，2型糖尿病8例，高脂血症9例，肥胖6例；吸烟4例。2组一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2 病例选择

1.2.1 诊断标准 西医诊断参照《非ST段抬高型急性冠状动脉综合征诊断和治疗指南(2016)》[7]。①症状：典型心绞痛，表现为发作性胸骨后或心前区闷痛，压榨紧缩感，可放射至左肩背、左臂(可达无名指和小指)、颈部、下颌部等，可伴有出汗、心悸、恶心、呕吐、呼吸困难、窒息感，甚至晕厥。②一般无异常体征，可见心率增快，血压升高，汗出，焦虑或惊恐。③心电图：追踪静息时心电图、心绞痛发作时心电图和心电图连续动态监测，ST-T波动态变化最具诊断价值。ST段压低≥0.1 mV，或T波倒置≥0.1 mV。④心肌损伤标志物：心肌肌钙蛋白I(cTnI)、肌钙蛋白T(cTnT)、肌酸激酶(CK)及肌酸激酶同工酶(CK-MB)正常或轻度异常。⑤冠状动脉造影：冠状动脉狭窄≥50%。根据病史、典型的心绞痛症状及相关辅助检查，结合年龄和存在的冠心病危险因素，即可建立诊断。

中医诊断参考《中医内科常见病诊疗指南：中医病证部分》[8]拟定。①寒凝：心胸疼痛，感寒疼痛加剧，肢体寒冷，苔薄白，脉沉紧。②痰浊：心胸窒闷或如物压，身重困倦，胸脘痞闷，口黏腻不爽，咯吐痰涎，苔白腻或白滑，脉滑。③血瘀：心痛不已，刺痛感，痛处固定，胸闷心悸，舌紫或黯，舌有瘀斑，或舌下络脉青筋暴露，脉涩。④气滞：胸痛时作，痛无定处，胸胁胀满，情志不畅可诱发或加重，或脘腹胀闷，嗳气或矢气则舒，时欲太息，脉弦。

1.2.2 纳入标准 符合上述西医诊断及中医证素诊断标准中的任一证素；年龄30～80岁；受试者知情同意；本研究经医院医学伦理委员会审批通过。

1.2.3 排除标准 急性心肌梗死、肺栓塞、主动脉夹层、左室流出道梗阻性疾病(如主动脉瓣狭窄、梗阻性肥厚型心肌病)等；急性感染、凝血功能异常者；严重肝、肾疾病及肿瘤、精神病患者。

1.3 治疗方法

1.3.1 对照组 予西医标准治疗。根据文献[7]制定方案，进行抗栓治疗、他汀类、抗心肌缺血治疗。阿司匹林肠溶片(Bayer S.p.A，国药准字J20130078)100 mg，每日1次口服；硫酸氢氯吡格雷片(乐普药业股份有限公司，国药准字H20123115)75 mg，每日1次口服；阿托伐他汀钙片(北京嘉林药业股份有限公司，国药准字H19990258)20 mg，每晚1次口服；琥珀酸美托洛尔缓释片(AstraZeneca AB，国药准字J20150044)47.5 mg，每日1次口服；单硝酸异山梨酯分散片(鲁南贝特制药有限公司，国药准字H20052095)20 mg，每日2次口服。

1.3.2 治疗组 在对照组治疗基础上加枳实薤白桂枝汤。药物组成：枳实12 g，厚朴12 g，薤白9 g，桂枝6 g，瓜蒌皮12 g，瓜蒌仁12 g。日1剂，水煎2次取汁300 mL，分早、晚2次温服。

1.3.3 疗程 2组均连续治疗2周。

1.4 观察指标及方法

1.4.1 中医证候评分 参照文献[8]拟定评分标准。主症胸痛胸闷分为无、轻度、中度、重度4个等级，分别记0、2、4、6分；次症心悸、气短、畏寒、体寒肢冷、痰涎、口黏、善太息、脘腹胀闷分为无、轻度、中度、重度4个等级，分别记0、1、2、3分。舌苔、脉象：舌质淡，舌体胖大边有齿痕，或苔白滑、白腻或浊腻，舌质紫黯，或有瘀斑，脉沉紧、脉滑、脉涩、脉弦，舌苔、脉象异常各记2分，正常记0分。

1.4.2 心绞痛情况 观察并记录2组治疗前后心绞痛发作次数(每周)和持续时间、硝酸甘油用量(每周)。

1.4.3 血清MMP-9水平 收集2组患者治疗前后空腹肘静脉血2 mL，3000 r/min离心10 min，分离出血清，-80 ℃低温保存，采用双抗体夹心酶联免疫吸附法测定MMP-9水平，试剂盒为上海信然实业有限公司生产。

1.4.4 MMP-9基因表达水平 采用实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)测定。①全血总RNA抽提。治疗前后收集2组患者静脉血2 mL，注入2%乙二胺四乙酸二钠抗凝管，加入TRIzol试剂，按照试剂盒(上海博彩生物科技有限公司)说明书提取全血总RNA，-80 ℃冰箱保存总RNA提取物。采用BIO-RAD SmartSpecTMPlus核酸蛋白测量仪(美国BIO-RAD公司)测定RNA浓度，相对定量检测采用实时荧光定量PCR技术进行。②cDNA合成。按照TAKARA逆转录反应试剂盒[宝生物工程(大连)有限公司]说明书将总RNA逆转录合成cDNA。③实时荧光定量PCR反应。将cDNA加入扩增反应体系，行实时荧光定量PCR检测。采用SYBR®PrimeScriptTMRT-PCR KitⅡ试剂盒[DRR083S，宝生物(大连)工程有限公司]，LightCycler®480实时荧光定量PCR仪(美国罗氏)。实时荧光定量PCR反应体系为20 μL，包括2×SYBR®Premix Ex TaqTM，1ng-100 ng cDNA，50 pmol/μL引物。两步法PCR循环条件：95 ℃预变性30 s，1个循环；95 ℃变性30 s，60 ℃退火、延伸20 s，40个循环；溶解曲线分析 95 ℃ 1 s，65 ℃ 15 s， 95 ℃ 1 s。④实时荧光定量PCR校正品构建及相对定量分析。采用LightCycler Relative Quantification (Version 1.5)软件进行相对定量分析，标准化比值计算公式采用2-△△CT法。设甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为内参基因。内参基因和目的基因校正品均使用20个健康样本外周血总RNA。△CT (样本)= CT目的基因- CT内参基因，△CT (校正品)= CT目的基因- CT内参基因，△△CT = △CT (样本)- △CT (校正品)。△△CT(2-△△CT值)即为MMP-9基因表达的相对定量值。引物设计由南京金斯瑞公司完成，引物序列见表1。

表1 引物序列

2 结果

2.1 2组治疗前后中医证候评分比较 见表2。

表2 2组治疗前后中医证候评分比较 分，

由表2可见，治疗后治疗组胸痛胸闷、心悸、气短、畏寒、体寒肢冷、脘腹胀闷、舌脉评分及总分均较本组治疗前下降，且均低于对照组治疗后，比较差异均有统计学意义(P<0.05)；治疗后对照组胸痛胸闷、心悸、气短评分及总分均较本组治疗前下降，比较差异均有统计学意义(P<0.05)

2.2 2组治疗前后心绞痛情况比较 见表3。

表3 2组治疗前后心绞痛情况比较

由表3可见，治疗后2组心绞痛发作次数、持续时间及硝酸甘油用量均较本组治疗前降低，且治疗组均低于对照组，比较差异均有统计学意义(P<0.05)。

2.3 2组治疗前后血清MMP-9及其基因表达水平比较 见表4。

表4 2组治疗前后血清MMP-9及其基因表达水平比较

由表4可见，治疗后2组血清MMP-9水平及其基因表达水平均较本组治疗前降低，且治疗组治疗后血清MMP-9水平低于对照组治疗后，比较差异均有统计学意义(P<0.05)。

3 讨论

UA是一种心血管慢性炎症的急性恶化疾病，其主要病理过程有血管内膜损伤、脂质沉积、斑块形成、斑块破裂和血栓形成。动脉粥样硬化是对血管内皮损伤的一种保护性炎性反应，表现为纤维增生，如果损伤持续，则回应过度，最终形成斑块[9]。在动脉粥样硬化斑块的整个形成过程中，脂质沉积是早期损伤反应的表现。白细胞和单核细胞激活成活化的巨噬细胞，通过清道夫受体摄取氧化低密度脂蛋白胆固醇(ox-LDL-C)，成为泡沫细胞。泡沫细胞死亡后，释放血浆脂蛋白和胆固醇酯，并沉降堆积，构成斑块内脂质池。炎性反应继续，引发纤维性增生，生成斑块表面的纤维帽。纤维帽的主要成分是平滑肌细胞，由血管内皮中膜的平滑肌细胞增殖、迁移而成。此类平滑肌细胞无法维持正常的收缩性能，可以分泌胶原蛋白、蛋白多糖和一些整合素，这些物质是ECM的重要组成部分。早期的动脉粥样硬化斑块脂质池小，纤维帽厚，斑块表现为稳定状态，但伴随着血浆脂蛋白的沉积，脂质池逐渐变大，与此同时，单核-巨噬细胞或肥大细胞浸润分泌蛋白酶(具有水解能力)，特别是金属蛋白酶，通过降解胶原纤维和抑制纤维的合成，使得纤维帽变薄，斑块破裂的风险增大，斑块由稳定向不稳定状态转变，外在常见因素有血压增高、血管痉挛、血管收缩和扩张产生的剪切力，在内、外因素的合力影响下，斑块破裂，导致UA的发生。易损斑块的破裂与纤维帽厚度、脂质核心大小、炎性反应强度有着紧密关系。目前，UA的临床治疗以药物治疗为主，如抗血小板聚集药物(阿司匹林肠溶片、硫酸氢氯吡格雷片)、他汀类调节血脂药(阿托伐他汀钙片)、选择性β1受体阻滞剂(美托洛尔)、硝酸酯类药物(单硝酸异山梨酯)等以抑制血小板聚集，调节血脂，舒张冠状动脉，改善UA患者心绞痛症状，但患者用药后容易产生药物不良反应。

MMPs是一组系列蛋白水解酶，其浓度升高与纤维帽降解、ACS的发生呈线性相关[10-11]。研究表明，MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9表达在冠状动脉斑块中显著增加[12]。MMP-9属于MMPs家族的一员，其基因长7.7 kb，含13个外显子和12个内含子，位于染色体的20q11.2～13.1，26～27kbp区，其底物包含天然Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ、Ⅺ型胶原及变性Ⅰ型胶原、纤维蛋白原(FIB)和蛋白聚糖等[13]。MMP-9具有MMPs的共同结构特点，是一类蛋白水解酶，在体内以酶原的形式从细胞中释放出来，通过蛋白酶的级联反应被激活，其活性依赖于内源性Zn2+及Ca2+的存在。此外，MMP-9与弹性蛋白和明胶酶有较高的亲和力，因而具有较强的水解弹性蛋白和明胶的能力。研究证实，ACS患者MMP-9水平增高，且与斑块的易损性相关(用颈动脉血管超声评价斑块状态，可分为稳定斑块和不稳定斑块)，不稳定斑块中MMP-9的含量高于稳定斑块，对严重心绞痛、急性心肌梗死、再次血运重建、心源性死亡等心脏事件的发生有预测作用[14]。动物实验研究也表明，MMP-9在造模成功的动脉粥样硬化鼠的主动脉中高表达，提示MMP-9与动脉粥样硬化相关，且其浓度与冠状动脉病变支数和狭窄程度呈正相关性[15]。由此可推测，MMP-9可作为易损斑块的实验室标志物，对评估冠状动脉病变程度有一定价值，在一定程度上可指导临床诊治[16]。相关研究还发现，原发性高血压患者的MMP-9浓度升高，且与升主动脉弹性降低相关[17]。

UA属中医学“胸痹心痛”范畴。《金匮要略·胸痹心痛短气病脉证治》载“阳微阴弦，即胸痹而痛”，指出胸痹心痛的病机是上焦阳气虚，下焦阴寒盛，胸阳痹阻，又“今阳虚知在上焦，所以胸痹、心痛者，以其阴弦故也”，从正虚与邪盛2个方面揭示了胸痹心痛的病因病机，强调了上焦阳虚为发病之本，下焦阴寒、水饮、痰浊等邪气上逆为发病之标，为本虚标实之证，标实以寒凝、痰浊 、血瘀、气滞为主。寒为阴邪，其性凝滞，寒气侵袭人体，胸中凝结，脉管挛缩，血脉阻滞，发生胸痹。寒气侵心，抑遏胸阳，寒气凝滞，则血不行为瘀，气不行为滞；寒凝血瘀气滞使胸阳失运，心脉阻滞，胸痹而痛。气行不畅而为滞，心气郁结，运行无力，气血失畅，痹阻不通而发心痛。痰源于津不化，瘀源于血不行，痰浊黏腻，阻滞血液运行，血运不畅为血瘀，血瘀则气机痹阻，气不行则津不化，津液失于气化，凝结为痰浊。痰可致瘀，瘀可致痰，痰瘀胶结，更为壅滞，壅塞胸中，猝然心痛欲窒。寒凝、痰浊、血瘀、气滞等实邪痹阻胸阳，阻滞心脉，发为胸痹。

枳实薤白桂枝汤宣痹通阳，泻满降逆，适宜胸痹偏实证。瓜蒌皮清热化痰，利气开郁，宽胸散结；瓜蒌仁清润化痰；薤白辛散苦降，行气导滞，温通滑利，善散阴寒凝滞，通胸阳闭结，《本草纲目》载其“下气散血”，与瓜蒌皮、瓜蒌仁相配能化痰通阳，行气止痛，共为君药。枳实辛行苦降，善破气除痞，行气化痰以消痞，破气除满而止痛；厚朴苦燥辛散，能燥湿，又下气宽中、除胀满，还可燥湿消痰，下气平喘，《名医别录》云“主温中，消痰下气”，两者皆为臣药，以理气通脉。桂枝辛甘性温，辛散温通，温通经脉，散寒止痛，既可温扶脾阳以助运水，又可温肾阳，助心阳，通利血脉，为佐药，奏温散寒邪、通阳止痛之功。诸药配伍，振奋胸阳，消除阴寒，降散痰浊，畅利气机，则诸症可除。既往研究显示，枳实薤白桂枝汤能降低UA患者血清MMP-9、升高基质金属蛋白酶抑制剂-1(TIMP-1)的水平，调节ECM的动态平衡，提高粥样硬化斑块的稳定性，缓解心绞痛症状，促进心电图缺血性ST-T段改变的恢复[18-19]。

本研究结果显示，枳实薤白桂枝汤能够降低UA患者血清MMP-9水平及MMP-9基因表达水平(P<0.05)，且血清MMP-9水平较常规治疗更低(P<0.05)，从而更有效地防止冠状动脉粥样硬化斑块纤维帽消化降解，稳定易损斑块，从而发挥治疗作用，较常规治疗更能改善患者中医证候(P<0.05)，减少心绞痛发作次数、持续时间及硝酸甘油用量(P<0.05)，值得临床借鉴。