基于网络药理学及分子对接探讨“桂枝、附子、白术”治疗类风湿关节炎的作用机制※

黄伟峰 廖发杰 陈光星

(广州中医药大学第一临床医学院2020级硕士研究生，广东 广州 510405)

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种炎症性自身免疫性疾病，以累及周围关节为主，以滑膜炎为基本病理改变[1]。其病变部位以手足小关节为主，表现为疼痛、肿胀及功能受限，严重者会导致软骨破坏，造成关节畸形，甚至导致残疾。现代医学主要应用非甾体抗炎药、糖皮质激素和改善病情抗风湿药治疗RA[2]，但是此类药物对患者会造成一定的副作用。而中医药治疗RA发挥重要作用，副作用较少，临床应用广泛。

中医学对RA的认识历史悠久，早在《内经》中己有与本病近似的疾病记载，RA属痹证范畴，《素问·痹论》谓“风寒湿三气杂至，合而为痹”。后世医书中的“尪痹”“历节病”“骨痹”及“鹤膝风”等与RA症状相似[3]。国医大师路志正认为，RA主要病因病机为先天禀赋不足，素体正气亏虚，营卫不固，感受风寒湿热诸邪，或摄生不当感受非时之气，邪袭经络，留滞关节，气血不畅，痰瘀互结，深入骨骱而发病[4]。

桂枝为肉桂干燥嫩枝入药，味辛、甘，性温，功效发汗解肌，温通经脉，助阳化气，平冲降逆。附子为乌头子根入药，味辛、甘，性大热，有毒，功效回阳救逆，补火助阳，散寒止痛。白术为白术根茎入药，味甘、苦，性温，功效健脾益气，燥湿利水，止汗，安胎[5]。《神农本草经》记载桂枝有“利关节，补中益气”作用，而白术则“主风寒湿痹死肌，痉疸”，附子有治疗“躄拘挛，脚痛，不能行步”的作用。《本草汇言》曰“白术，乃扶植脾胃，散湿除痹，消食除痞之要药也”。鲁贤昌教授认为，痹证之寒胜者可选用桂枝、附子，而湿胜者则可选白术酌情加减[6]。马武开教授论治RA要重视脾胃，常用炒白术化湿邪，生气血[7]。相关药理研究表明，附子治疗RA的机制与其抗炎、调节免疫等作用有关[8-9]。

中医药调治RA在改善症状方面有较大优势。许飞等[10]通过回顾性分析 4028 例 RA 住院病例资料，认为RA 患者不同年龄段中医证候分布均以风寒湿痹为主要证候。金成等[11]回顾分析的438例RA患者中，风寒湿痹证最多。王建等[12]通过多中心收集1019例RA患者病例资料，结论得出湿热痹阻证占比最高，其次为寒湿痹阻证。根据对中医经典理论的探讨并结合临床经验，认为RA主要病机为风寒湿阻，治宜祛风散寒除湿，桂枝、附子、白术分别祛风、祛寒、祛湿，三药相伍，契合祛风散寒除湿之法。

随着中医药治疗RA研究日益深入，越来越需要从多成分、多靶点、多途径的角度解释中医药发挥治疗作用的机制。因此，本研究应用网络药理学探讨桂枝、附子、白术治疗RA的作用机制，为中药现代化提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 中药活性成分和作用蛋白质靶点的筛选 分别以“桂枝”“附子”“白术”为关键词在中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php)[13]进行检索，设置筛选条件为口服生物利用度(OB)≥30%、类药性(DL)≥0.15，收集符合条件的活性成分和其作用的蛋白质靶点。OB代表到达全身循环的未给药药物的口服剂量百分比，DL是用于药物设计的定性概念，是评价药代动力学的重要参数。

1.2 蛋白质靶点名称的标准化及“中药-活性成分-靶点”的网络构建 将1.1中收集到的靶点名称分别输入Uniprot数据库(https://www.uniprot.org)[14]，设置限定条件为已验证的人类基因，获取靶点蛋白基因名的标准表达。将1.1项中中药、活性化合物成分、蛋白质靶点导入Cytoscape 3.7.2软件，构建“中药-活性成分-靶点”网络图，并分析网络拓扑参数以获取中药治疗的关键成分。

1.3 RA疾病相关基因的筛选 利用GeneCards数据库(https://www.genecards.org)和DisGeNet数据库(https://www.disgenet.org)对RA的相关基因进行检索，在2个数据库分别输入关键词“rheumatoid arthritis”，设置种属为“智人”，分别获取疾病相关基因靶点。根据Relevance score值排序，若靶点信息过多，则选取大于中位数的靶点作为疾病的潜在靶点。因为Relevance score值表示该靶点与疾病联系的紧密度，数值越高联系越密切。收集到相关靶点信息后，合并2个数据库结果，除去重复值，获取最终预测的疾病靶点信息。

1.4 获取中药与疾病的共同靶点 将1.2和1.3中收集到的数据导入Excel工作表中，筛选中药“桂枝、附子、白术”和RA的交集靶点，作为此组中药干预RA的潜在作用靶点，交集结果通过韦恩图展示。

1.5 蛋白互作网络(PPI)构建 为了明确这组药物靶点与疾病靶点的相互作用，将1.4中筛选出的交集靶点导入STRING 11.0 数据库(https://string-db.org)[15]构建PPI。为确保可信度，选择基于证据的网络意义，将交互分数限定为>0.4，除去无相互作用的单一蛋白，利用 Cytoscape 3.7.2软件将 PPI 网络可视化，展示“桂枝、附子、白术”作用靶点蛋白与RA靶点蛋白之间的相互作用关系。

1.6 基因本体(GO)功能和京都基因和基因组百科全书(KEGG)通路富集分析 应用Metascape数据平台[16]分析“桂枝、附子、白术”治疗RA相关靶点信号通路，把1.4筛选出的共同靶点基因导入该平台进行GO和 KEGG 通路分析。GO富集分析包括分析生物功能(molecular function，MF)、生物过程(biological process，BP)、细胞组成(cellular components，CC)，而KEGG 富集分析可以筛选“桂枝、附子、白术”治疗RA的潜在作用信号通路。

1.7 分子对接验证 从TCMSP数据库搜索桂枝、附子、白术关键成分的结构，并保存为mol 2格式。分析1.5中网络图的度值，把相关参数排名前5的靶点作为核心靶点，查找其PDB ID，核心靶点的3D结构从 PDB 数据库(http://www.rcsb.org/)下载，并使用Pymol软件进行删除蛋白结构的水分子和小分子配体等预处理。通过 AutoDock 软件进行分子对接，先将靶点蛋白和小分子配体进行处理，转换成pdbqt文件，然后用AutoDockTools对接并计算结合能，最后用Pymol 进行数据可视化。

2 结果

2.1 “桂枝、附子、白术”中药活性成分和作用靶点的获取 通过 TCMSP 检索桂枝、附子、白术中符合条件的主要活性成分共20个，其中来自白术的7个，来自附子的6个，来自桂枝的8个，而谷甾醇为附子与桂枝共有成分，分别给各个活性成分做标记(见表1)。白术成分作用靶点19个、附子成分作用靶点18个、桂枝成分51个，合并后删除重复值共得到靶点70个。

表1 中药“桂枝、附子、白术”的主要活性成分

2.2 “中药-活性成分-靶点”网络的构建 将桂枝、附子、白术对应的20个活性成分、70个蛋白质靶点的相互关系导入Cytoscape 3.7.2软件，绘制“中药-活性成分-靶点”网络图(见图 1)。对该网络进行拓扑分析，按连接度(Degree)排序，活性成分中GZ3为最大值38，其后依次为BZ6、GZ6、GZ4、FZ3，故预测以上5个成分为主要治疗成分，并结合表1获取成分的名称，分别是β-谷甾醇(GZ3)、3β-白术乙酰基(BZ6)、花旗松素(GZ6)、儿茶素(GZ4)、德尔妥因(FZ3)。

图1 中药-活性成分-靶点网络

2.3 RA疾病相关基因的筛选和中药活性成分与疾病共同靶点的获取 以“rheumatoid arthritis”为关键词在GeneCards数据库中检索获取疾病靶点2238个，其中Relevancescore最大值为110.06，最小值为1.44，中位数为3.28，故设定Score>3.28的靶点为潜在靶点。结合DisGeNet数据库补充相关靶点，合并后删除重复值，最终得到1870个疾病相关靶点。通过分析得到中药活性成分与RA疾病的共同靶点36个(见图2)，这36个共同靶点作为“桂枝、附子、白术”治疗RA的预测靶点。

图2 中药活性成分靶点与RA疾病靶点交集韦恩图

2.4 PPI构建 将2.3中获取的36个交集靶点导入STRING数据库中进行分析，得到“桂枝、附子、白术”治疗RA对应靶点的 PPI初步图(见图3)，删去无相互关系的蛋白后，共涉及34个靶点。将生成的tsv文件导入 Cytoscape 3.7.2软件，对所获取PPI进行可视化处理(见图4)。

图3 STRING制作的PPI初步图

图4 Cytoscape可视化图

Cytoscape 3.7.2网络拓扑分析提示，该网络节点的平均度值7.310，有13个大于平均度值，其中白细胞介素6(IL-6)(连接度为26，介度为 0.1287，紧密度为0.8048)，其次为肿瘤坏死因子(TNF)(连接度为24，介度为0.0867，紧密度为0.7674)、血管内皮生长因子A(VEGFA)(连接度为23，介度为0.0664，紧密度为0.7174)、IL-1β(连接度为21，介度为0.0446，紧密度为0.6875)、前列腺素内过氧化物合酶2(PTGS2)(连接度为20，介度为0.0847，紧密度为0.6875)，故设定IL-6、TNF、VEGFA、IL-1β、PTGS2为中药“桂枝、附子、白术”治疗RA的核心靶点。

2.5 GO功能和KEGG通路富集分析 将36个交集靶点基因提交至Metascape数据库进行信号通路分析，其中KEGG 富集显示182条通路，剔除广泛通路后共获得34条信号通路，按-log10(P)值排序后绘制成高级气泡图(见图5)。而GO功能富集分析结果显示BP包含了982个GO术语条目，CC 40个，MF53个，按-log10(P)值排序后取排名前20个GO条目绘制成柱状图(见图6)。

图5 KEGG通路富集分析

图6 排名前20的 GO功能富集分析

2.6 分子对接验证 将2.4中筛选得到的核心靶点与“桂枝、附子、白术”的5个主要活性成分进行分子对接，其中最低结合能≤-5 kJ/mol表明药物活性成分与核心靶点蛋白具有较好的结合作用。对接结果说明了“桂枝、附子、白术”中活性成分与 RA 中核心靶点有着良好的结合作用。其中TNF与β-谷甾醇结合力最好，PTGS2与花旗松素、IL-6与3β-白术乙酰基、IL-1β与花旗松素、TNF与德尔妥因对接也有较好的结合活性(见表2、图7)。

图7 桂枝、附子、白术主要活性成分与靶点对接的部分结果

表2 分子对接结果 kJ/mol

3 讨论

本研究从“桂枝、附子、白术”中筛选得到20个活性成分和70个活性成分作用靶点。通过分析“中药-活性成分-靶点”网络，推测β-谷甾醇、3β-白术乙酰基、花旗松素、儿茶素和德尔妥因5个成分是“桂枝、附子、白术”治疗RA的主要活性成分。相关研究表明，β-谷甾醇可调节巨噬细胞功能，可能是有希望的RA治疗药物[17]。花旗松素可减少促炎细胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β，具有抗炎作用[18]，通过抑制核因子κB(NF-κB)信号通路抑制破骨细胞生成，对破骨细胞生成相关疾病如骨质疏松症、骨溶解和RA具有治疗潜力[19]。3β-白术乙酰基属于白术内酯类成分，有研究显示白术挥发油成分在抗炎、抗肿瘤方面有一定效果，能降低TNF-α、IL-1细胞因子水平[20]。相关动物实验表明，儿茶素可能通过抑制滑膜细胞分泌前列腺E2(PGE2)、IL-1和TNF-α等环节降低关节炎大鼠关节滑膜细胞分泌功能[21]。德尔妥因相关研究较少，但本研究发现该分子能与较多RA靶点连接。分子对接验证结果亦表明，这组中药的主要成分与RA主要靶点的结合活性较强。通过PPI分析并构建相关网络，筛选到IL-6、TNF、VEGFA、IL-1β、PTGS2等36个核心靶点蛋白，这些蛋白共同参与调控RA的发展。IL-6、TNF、IL-1β等都是RA的经典靶点，PTGS2是前列腺素生物合成中的关键酶，已证实PTGS2在许多病理生理过程中具有重要作用，它的表达也与关节炎密切相关[22]。这些靶点参与了调节治疗RA的众多复杂通路。

GO功能富集结果提示，“桂枝、附子、白术”可能主要是通过促进成骨细胞分化、抑制凋亡、控制炎症等途径发挥对RA的治疗作用。对34条KEGG信号通路进行分析，发现主要发挥了2类作用。①调控炎症因子的水平：TNF信号通路(hsa04668)是富集得到的关键通路，已有研究表明TNF可通过级联反应增加趋化因子的产生，从而促进炎症因子的表达和释放，在RA患者中加重炎性反应[23]。通过干预IL-17细胞信号通路(ko04657)可有效影响IL-17的分泌[24]，在RA患者滑膜中IL-17可与其他细胞因子协同促进炎性反应[25]。缺氧诱导因子1(HIF-1)可激活NLRP3的表达，而NLRP3参与了炎症小体的组装和IL-1β的加工[26]。②调控细胞周期：有研究认为，磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信号通路(hsa04151)参与滑膜细胞的增殖与凋亡调节，在RA滑膜细胞中处于异常激活状态[27]，它的激活促使PI3K和Akt蛋白高表达，降低促凋亡蛋白的表达，抑制软骨细胞的凋亡，从而减缓软骨细胞的退变[28]。晚期糖基化终末产物(AGE)-晚期糖基化终末产物受体(RAGE)信号通路(ko04933)在RA的发生发展过程中起到重要作用，诱导细胞凋亡，促进新生血管生成。由此可见，“桂枝、附子、白术”对RA的治疗作用可能是通过活性成分调控炎症因子水平、调控细胞周期而实现。

综上所述，本研究运用网络药理学的方法，探究了“桂枝、附子、白术”治疗RA的机制，同时采用分子对接方法对核心靶点与关键成分进行对接验证。该组中药可能是通过β-谷甾醇、3β-白术乙酰基、花旗松素等化合物成分调控IL-6、TNF、VEGFA、IL-1β、PTGS2等疾病靶点，干预AGE-RAGE信号通路、TNF信号通路、IL-17信号通路等炎症经典通路，从调控炎症因子水平和细胞周期方面发挥对RA的治疗作用。这项研究有一些局限性，如在中药剂量和水溶性等方面尚需进行深入探索，仅挖掘现有数据库并预测了“桂枝、附子、白术”治疗RA的药理作用机制，然而其结果的可靠性和合理性尚需实验进一步验证。