合真醒神香穴位贴敷和香熏预处理对大鼠卒中缺血再灌注损伤的保护作用机制研究※

赵晓丽 李培雯 刘婉玉 宗兆睿 夏 天 付 于

(天津中医药大学第一附属医院生殖中心，天津 300193)

缺血性卒中是临床上常见的心脑血管疾病，且近年来发病人群趋于年轻化[1-2]。缺血性卒中后尽快恢复再灌注能有效减少缺血造成的脑损伤，但再灌注也会产生钙超载、炎性反应激活、线粒体损伤等再灌注损伤，导致神经细胞凋亡、坏死，造成不可逆损伤[3-4]。相关研究表明，卒中发生后积极有效的干预处理可以有效减轻卒中缺血再灌注造成的脑损伤[5]。合真中华药香是天津市非物质文化遗产，秉承着“药借香气，香借药性”的中医内病外治理念，在防病、治病方面优势明显。本研究将合真醒神香应用于卒中后再灌注损伤的防治，通过观察合真醒神香穴位贴敷和香熏预处理对卒中缺血再灌注损伤模型大鼠的保护作用，探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 雄性SD大鼠72只，8周龄，体质量260～280 g，均购自北京维通利华实验动物公司[许可证号：SCXK(京)2016-0006]，常规适应性饲养7 d后进行实验。

1.2 实验药物 合真醒神香主要成分包括沉香30 g、苏合香5 g、安息香15 g、麝香0.3 g、冰片3 g、楠木粉黏合剂，由合真药香文化艺术馆(天津)有限公司提供。

1.3 实验试剂及仪器

1.3.1 主要试剂 氯化三苯四氮唑(TTC)染色液、尼氏染色液(焦油紫法)、通用P物质(SP)检测试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)；大鼠白细胞介素1β(IL-1β)、干扰素γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)酶联免疫吸附(ELISA)法检测试剂盒(达科为生物技术股份有限公司)；抗天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3(anti-Caspase-3)抗体(北京博奥森生物技术有限公司)；抗B淋巴细胞瘤2相关X蛋白(anti-Bax)抗体(英国Abcam公司)；抗B淋巴细胞瘤2(p65)[anti-Bcl-2(p65)]抗体(美国Bioworld公司)；苏木素-伊红(HE)染色试剂盒[生工生物工程(上海)股份有限公司]；原位末端标记法(TUNEL)细胞凋亡检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)。

1.3.2 主要仪器 多功能酶标仪(美国Thermo公司)；荧光显微镜、冷冻切片机(德国Leica公司)；光学显微镜(日本Olympus公司)；台式低速离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)；组织研磨机(南京先欧仪器制造有限公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 实验分组及给药 将72只大鼠随机分为假手术组、模型组、穴位贴敷组、穴位贴敷对照组、香熏组、香熏对照组，每组12只。假手术组和模型组大鼠均正常饲养14 d，不予任何药物预处理。穴位贴敷组予合真醒神香穴位贴敷预处理14 d，贴敷前对大鼠腕部进行脱毛处理，将合真醒神香粉碎成细粉，根据成人常规剂量以体表面积换算成等效剂量0.75 g，再以生姜汁调和成糊状，贴敷于大鼠“内关”及“外关”，并以胶布固定，每日更换2次。穴位贴敷对照组予楠木粉黏合剂贴敷预处理14 d，取穴和给药方式同穴位贴敷组。香熏组予合真醒神香香熏预处理14 d，即将大鼠笼放置在15 m2的房间，在笼旁点燃合真醒神香，保持鼠笼空气流通，紧闭门窗但不密封，以保持空气中的熏香浓度稳定，每次香熏15 min，每日1次。香熏对照组予楠木粉黏合剂香熏预处理14 d，香熏方法同香熏组。

1.4.2 建立模型 各组大鼠预处理14 d后，除假手术组外，其余各组参照文献[9，10]中方法建立大脑中动脉缺血再灌注损伤模型。首先以10%水合氯醛按0.34 mL/100 g腹腔注射麻醉大鼠，然后仰卧固定于手术台上，常规皮肤消毒，颈正中剪长约3 cm切口，钝性分离右侧胸锁乳突肌与胸骨锁骨肌，分离右侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉，避免损伤迷走神经。结扎颈内动脉颅外段的唯一分支翼腭动脉，再结扎颈总动脉近心端，于颈总动脉分叉处结扎颈外动脉，微动脉夹夹闭颈内动脉。在右侧颈总动脉接近分叉处剪一小口插入线栓并用手术线轻度结扎，松开微动脉夹，轻推线栓沿颈总动脉入颈内动脉至有阻力时止，系紧结扎线，线栓尾端露于体外。此时线栓头端入大脑前动脉，其体部阻挡住大脑中动脉入口，形成大脑中动脉供血中断，闭塞2 h后拔出线栓，形成再灌注。假手术组仅剥离颈总动脉后立即缝合创口。

1.5 观察指标及方法

1.5.1 神经功能缺损评分 再灌注24 h后参照文献[11]中评分方法对各组大鼠神经功能缺损评分进行比较。0分：无神经功能损伤；1分：左侧(瘫痪侧)前爪不能完全伸展；2分：左侧前肢不能伸展；3分：行走时，大鼠向左侧转大圈；4分：行走时，大鼠向左侧转小圈；5分：行走时，大鼠身体向左侧倾倒。

1.5.2 TTC染色观察脑梗死体积 神经功能检测完毕后，处死各组大鼠，迅速取脑组织，-20 ℃冷冻保存。切取冠状位脑片，厚度为2 mm，将脑片放入2%的TTC溶液中，37 ℃避光孵育30 min，每5 min轻微晃动容器，使充分染色。染色结束后，用4%多聚甲醛溶液固定脑片，拍照，每组3个样品，使用Image J 软件计算梗死部位体积占脑总体积的百分比[12-14]。

1.5.3 TUNEL法检测梗死脑组织细胞凋亡率 梗死脑组织冰冻切片，用4%多聚甲醛溶液固定30 min，磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗涤2次，每次10 min，使用0.5%聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)室温通透5 min。在组织上滴加TUNEL反应液，37 ℃避光孵育60 min。PBS洗涤3次，4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)避光复染5 min，再用PBS洗涤3次，抗荧光猝灭剂封片后，于荧光显微镜下观察。每组3个样品，采用Image J软件进行细胞计数，计算梗死脑组织细胞凋亡率。

1.5.4 HE染色观察梗死脑组织神经细胞形态 梗死脑组织冰冻切片，厚度8 μm。于蒸馏水中漂洗3 min，苏木素染色10 min，流动水冲洗5 min，0.1%盐酸-乙醇分色20 s，流动水冲洗1 min，PBS蓝化，经75%、85%、95%乙醇处理各10 s，伊红染色2 min，95%乙醇、无水乙醇脱水，二甲苯透明，封片后于光学显微镜下观察梗死脑组织神经细胞形态。

1.5.5 尼氏染色观察海马组织尼氏小体形态 海马区脑组织冰冻切片，蒸馏水漂洗1 min，梯度乙醇复水，切片置于尼氏染色液，56 ℃温箱浸染1 h，蒸馏水漂洗1 min，将切片置于分化液分化2 min，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，封片后于光学显微镜下观察海马区尼氏小体形态。

1.5.6 ELISA法检测海马区和皮质部细胞因子含量 取海马区和皮质部，称质量，按1∶9加入预冷的0.9%氯化钠注射液，匀浆，4000 r/min，离心10 min，取上清液。然后按照ELISA试剂盒操作说明书，使用多功能酶标仪测定560 nm吸光度，并根据标准品浓度绘制标准曲线，每组3个样品，分别计算海马区和皮质部IL-1β、IFN-γ、TNF-α的浓度。

1.5.7 免疫组化法检测梗死脑组织凋亡相关蛋白表达 梗死脑组织冰冻切片，用甲醇固定10 min，3%双氧水(H2O2)反应10 min，PBS洗涤3次，每次5 min，0.5% Triton X-100室温通透10 min，羊血清封闭30 min，一抗(1∶50)4 ℃孵育过夜，相应二抗室温孵育30 min，链酶亲和素-过氧化物酶反应液室温孵育30 min，二氨基联苯胺(DAB)显色30 min，苏木精轻度复染5 min，1%盐酸酒精分化30 s，蒸馏水冲洗蓝化，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，于光学显微镜下观察拍照，每组3个样品，使用Image J软件分析凋亡相关蛋白Caspase-3、Bax、Bcl-2染色阳性面积，计算相对表达情况及Bax/Bcl-2比值。

2 结果

2.1 各组大鼠神经功能缺损评分比较 见表1。

由表1可见，与假手术组比较，模型组大鼠神经功能缺损评分升高(P<0.05)。与模型组比较，穴位贴敷组和香熏组大鼠神经功能缺损评分均降低(P<0.05)，穴位贴敷对照组和香熏对照组与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05)。穴位贴敷组和香熏组分别与穴位贴敷对照组和香熏对照组比较，大鼠神经功能缺损评分均降低(P<0.05)。穴位贴敷组与香熏组大鼠神经功能缺损评分组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 各组大鼠神经功能缺损评分比较 分，

2.2 各组大鼠脑梗死体积百分比比较 见图1、表2。

假手术组 模型组 穴位贴敷组 穴位贴敷对照组 香熏组 香熏对照组

表2 各组大鼠脑梗死体积百分比比较

由表2可见，与假手术组比较，模型组大鼠脑梗死体积百分比增加(P<0.05)。与模型组比较，穴位贴敷组大鼠脑梗死体积百分比减小(P<0.05)，穴位贴敷对照组、香熏组、香熏对照组与模型组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。与穴位贴敷对照组比较，穴位贴敷组大鼠脑梗死体积小于穴位贴敷对照组(P<0.05)，香熏组与香熏对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。穴位贴敷组大鼠脑梗死体积百分比小于香熏组(P<0.05)。

2.3 各组大鼠梗死脑组织细胞凋亡率比较 见图2、表3。

图2 各组大鼠梗死脑组织细胞凋亡情况[DNA片段用FITC标记(绿色荧光)，细胞核用DAPI标记(蓝色荧光)，×40]

表3 各组大鼠梗死脑组织细胞凋亡率比较

由表3可见，与假手术组比较，模型组大鼠梗死脑组织细胞凋亡率升高(P<0.05)。与模型组比较，穴位贴敷组和香熏组大鼠梗死脑组织细胞凋亡率均降低(P<0.05)，穴位贴敷对照组和香熏对照组与模型组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。穴位贴敷组和香熏组分别与穴位贴敷对照组和香熏对照组比较，大鼠梗死脑组织细胞凋亡率均降低(P<0.05)。穴位贴敷组和香熏组大鼠梗死脑组织细胞凋亡率组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.4 各组大鼠梗死脑组织海马区和皮质部IL-1β、IFN-γ、TNF-α水平比较 见表4。

表4 各组大鼠梗死脑组织海马区和皮质部IL-1β、IFN-γ、TNF-α水平比较

由表4可见，与假手术组比较，模型组大鼠海马区和皮质部IL-1β、IFN-γ、TNF-α水平均升高(P<0.05)。与模型组比较，穴位贴敷组大鼠海马区和皮质部IL-1β、IFN-γ、TNF-α水平均下降(P<0.05)，香熏组大鼠仅海马区IL-1β、IFN-γ、TNF-α水平下降(P<0.05)，皮质部各指标虽也有下降趋势，但比较差异均无统计学意义(P>0.05)，穴位贴敷对照组和香熏对照组海马区和皮质部各指标与模型组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。与穴位贴敷对照组比较，穴位贴敷组大鼠海马区和皮质IL-1β、IFN-γ、TNF-α水平均低于穴位贴敷对照组(P<0.05)，与香熏对照组比较，香熏组仅海马区IL-1β、IFN-γ、TNF-α水平和皮质部IFN-γ水平低于香熏对照组(P<0.05)。穴位贴敷组大鼠皮质部IL-1β、IFN-γ、TNF-α水平均低于香熏组(P<0.05)。

2.5 各组大鼠梗死脑组织神经细胞形态和海马区尼氏小体形态观察 假手术组脑组织形态清晰，神经细胞排列密集，神经元胞浆丰富，胶质细胞结构完整，排列致密，细胞周围间隙无水肿，海马区尼氏小体排列紧密，数量繁多。模型组梗死脑组织可见大片神经细胞消失，细胞稀疏，排列紊乱，间质疏松，神经元、胶质细胞周围间隙明显增宽，神经纤维疏松，海马区尼氏小体明显减少，排列稀疏，形态不规则。穴位贴敷组和香熏组梗死脑组织神经细胞数量较模型组明显增多，细胞排列较紧密，神经元、胶质细胞周围间隙缩小，海马区尼氏小体较模型组形态规则，数量增多。穴位贴敷对照组和香熏对照组梗死脑组织神经细胞形态和海马区尼氏小体形态与模型组类似。见图3、4。

图3 各组大鼠梗死脑组织脑细胞形态(HE染色，×20)

图4 各组大鼠梗死脑组织海马区尼氏小体形态(尼氏染色，×40)

2.6 各组大鼠梗死脑组织Caspase-3、Bax、Bcl-2相对表达情况及Bax/Bcl-2比较 见图5、表5。

Caspase-3

表5 各组大鼠梗死脑组织Caspase-3、Bax、Bcl-2相对表达情况及Bax/Bcl-2比较

由表5可见，与假手术组比较，模型组大鼠梗死脑组织Caspase-3、Bax、Bcl-2、Bax/Bcl-2水平均增加(P<0.05)。与模型组比较，穴位贴敷组和香熏组大鼠梗死脑组织Caspase-3、Bax、Bax/Bcl-2水平均降低(P<0.05)，穴位贴敷组Bcl-2水平升高(P<0.05)，穴位贴敷对照组和香熏对照组各指标与模型组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。与穴位贴敷对照组比较，穴位贴敷组大鼠梗死脑组织Caspase-3、Bax、Bax/Bcl-2水平均低于穴位贴敷对照组(P<0.05)，Bcl-2水平高于穴位贴敷对照组(P<0.05)，与香熏对照组比较，香熏组大鼠梗死脑组织Caspase-3、Bax、Bax/Bcl-2水平均低于香熏对照组(P<0.05)。穴位贴敷组大鼠梗死脑组织Bcl-2水平高于香熏组(P<0.05)，Bax/Bcl-2水平低于香熏组(P<0.05)。

3 讨论

缺血性卒中又称为脑梗死，是由于各种原因引起脑组织血液供应障碍，从而导致脑组织缺血、缺氧性病变坏死，并出现一系列的神经功能缺损症状，属于临床上的急症、重症，具有高致残率、高致死率的特点[15]。早期的静脉溶栓治疗是治疗急性缺血性卒中的重要方法，通过静脉输注溶栓药物治疗，溶解堵塞血管的血栓，从而最大限度地减轻因缺血、缺氧造成的脑细胞损伤，对患者神经缺损功能的恢复具有重要临床意义[16]。但大量临床研究发现，部分患者采用静脉溶栓治疗在快速恢复梗死部位再灌注的同时，也带来更为严重的损伤，并将这种现象称为缺血再灌注损伤，是伴随缺血性卒中的治疗而产生，一般认为其损伤机制包括氧化应激、线粒体功能障碍、炎性反应、血脑屏障破坏、细胞凋亡等[17]。

神经细胞凋亡增加是引起缺血再灌注损伤的重要原因，导致缺血区域神经细胞死亡，细胞数量减少甚至消失，特别是海马区细胞损伤，尼氏小体的数量明显减少。Bax基因是人体最主要的凋亡基因，当发生脑缺血时可导致Bax转移至线粒体外膜，使线粒体外膜通透性增加，促进细胞色素C(Cyt-C)和凋亡诱导因子(AIF)释放，激活Caspase-3介导的内源性细胞凋亡途径[18]。研究显示，缺血再灌注损伤可进一步导致促凋亡蛋白Caspase-3和Bax表达增加，抗凋亡蛋白Bcl-2表达降低，导致细胞凋亡明显增加[19]。Bcl-2能够通过稳定线粒体膜电位，抑制Cyt-C的释放，发挥抑制凋亡作用，Bcl-2还可与Bax形成二聚体，当Bax相对量高于Bcl-2时，Bcl-2与Bax形成同二聚体，促进细胞凋亡，当Bcl-2相对量高于Bax时，Bcl-2与Bax形成异二聚体，抑制细胞凋亡[20]。因此，Bax与Bcl-2的平衡，是细胞凋亡途径中的重要调节因子，决定了细胞的凋亡与存活。Zhang Y等[21]使用糖氧剥夺/复氧(OGD/R)方法模拟离体缺血再灌注，结果显示降低Bax/Bcl-2能促进细胞存活。Leung S W等[22]研究发现，大黄素可通过细胞外信号调节激酶(ERK)1/2通路增加Bcl-2表达，降低Caspase-3表达，发挥抑制线粒体凋亡作用，降低缺血再灌注导致的氧化应激损伤，具有神经保护作用。本实验研究结果显示，与假手术组比较，模型组大鼠神经功能缺损评分升高(P<0.05)，脑组织出现大面积梗死(P<0.05)，细胞凋亡率增加(P<0.05)，梗死脑组织中Caspase-3、Bax、Bcl-2、Bax/Bcl-2水平均增加(P<0.05)，镜下观察显示梗死脑组织神经细胞数量明显减少，排列紊乱，海马区尼氏小体明显减少，排列稀疏。

神经炎性反应是介导缺血再灌注损伤的另一个重要机制。IL-1β是一种关键的促炎细胞因子，参与多种自身免疫性炎性反应和多种细胞活动，IL-1β的局部激活是介导促炎反应的中心环节，IL-1β介导缺血后脑水肿等病理损伤，抑制IL-1β能减少中性粒细胞浸润和脑水肿[23]。TNF-α是一种多向性的促炎细胞因子，主要由活跃的巨噬细胞和单核细胞分泌，TNF-α表达的增加则可产生损伤性生物学效应[24]。IFN-γ是主要由T淋巴细胞和自然杀伤(NK)细胞分泌的多功能细胞因子，可介导黏附分子表达，促进烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶的产生，活化小胶质细胞、巨噬细胞产生IL-1β、TNF-α等，加重神经性炎性反应，并产生活性氧(ROS)、一氧化氮(NO)等造成氧化应激损伤，ROS通过活化丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路亦可促进炎症因子释放，并诱导线粒体凋亡途径，导致细胞凋亡[25-26]。研究显示，抑制炎症因子释放或给予抗炎治疗能减少小胶质细胞的激活，减轻神经炎症，减少脑水肿，具有神经保护作用[27-28]。本实验研究结果显示，与假手术组比较，模型组大鼠海马区和皮质部的IL-1β、IFN-γ、TNF-α水平均增加(P<0.05)，说明缺血再灌注损伤导致梗死脑组织炎性反应加剧。

缺血性卒中属中医学中风的范畴，元气虚衰，风、火、痰、瘀损伤脑络，气血瘀阻，导致窍闭神匿，神不导气是其发病的主要病因病机，故治疗应以醒脑开窍、活血通络为主。中医自古就有“芳香避秽”的说法，是指芳香气味的中药多具有祛瘟除秽、避疫防病、醒脑开窍、扶正祛邪的功效，是中医防病治病的重要方法[29]。合真醒神香是以芳香开窍药为主制成，主要成分包括沉香、苏合香、安息香、麝香、冰片。方中沉香温肾通心，沁人心脾；苏合香开窍辟秽，开郁豁痰；安息香开窍清神，行气活血；麝香开窍醒神，活血通经；冰片开窍醒神，清热散毒。研究表明，芳香开窍中药可通过抗氧化损伤、抑制炎症因子表达、减少神经细胞凋亡等作用保护卒中后脑组织损伤[30]；沉香对氨基酸类神经递质的分泌具有调节作用，从而起到镇静安神的功效[31]；苏合香可明显改善缺血再灌注损伤大鼠的神经行为学评分，通过影响凝血功能增加正常及缺血状态下血脑屏障通透性发挥脑保护作用[32]，苏合香挥发油还可通过抑制神经细胞Toll样受体9(TLR9)的表达，降低Caspase-3表达量，抑制细胞凋亡，促进神经细胞存活[33]；安息香可通过抑制TNF-α等炎症因子的释放，从而减少内皮细胞的损伤[34]；麝香可能通过抑制实验性脑缺血模型大鼠缺血区小胶质细胞增生介导的炎性反应，减轻脑水肿，促进神经功能恢复[35]；冰片、麝香等芳香开窍药能显著降低缺血再灌注损伤大鼠的血管内皮生长因子(VEGF)含量，维持血管内皮细胞、星形胶质细胞的正常形态，发挥血脑屏障保护作用[36]，冰片还可抑制缺血再灌注损伤神经细胞内ROS、NO的产生，抑制核转录因子κB(NF-κB)诱导的炎性反应，逆转神经元损伤[37]。穴位贴敷和香熏疗法都属中药外治范畴，清·吴尚先在《理瀹骈文》中有言“外治之理，即内治之理，外治之药，即内治之药，所异者法耳”，充分概括和肯定了外治的治疗作用。穴位贴敷是通过透皮吸收，香熏疗法是通过呼吸道黏膜吸收，两者略有不同，但药物有效成分均可“切于皮肤，彻于肉理，摄于吸气，融于渗液”(清·吴尚先《理瀹骈文》)，从而通经走络，直达脏腑。本实验研究结果显示，与模型组比较，穴位贴敷组大鼠神经功能缺损评分降低(P<0.05)，脑梗死体积减小(P<0.05)，梗死脑组织细胞凋亡率降低(P<0.05)，海马区和皮质部IL-1β、IFN-γ、TNF-α水平均下降(P<0.05)，梗死脑组织Caspase-3、Bax、Bax/Bcl-2水平均降低(P<0.05)，Bcl-2水平升高(P<0.05)，镜下观察显示梗死脑组织神经细胞形态和海马区尼氏小体形态均有改善；与模型组比较，香熏组大鼠神经功能缺损评分降低(P<0.05)，梗死脑组织细胞凋亡率降低(P<0.05)，海马区IL-1β、IFN-γ、TNF-α水平均下降(P<0.05)，梗死脑组织Caspase-3、Bax、Bax/Bcl-2水平均降低(P<0.05)，镜下观察显示梗死脑组织神经细胞形态和海马区尼氏小体形态均有改善；穴位贴敷对照组和香熏对照组各指标与模型组比较差异均无统计学意义(P>0.05)；2个治疗组组间比较，穴位贴敷组大鼠脑梗死体积小于香熏组(P<0.05)，皮质部IL-1β、IFN-γ、TNF-α水平均低于香熏组(P<0.05)，梗死脑组织Bcl-2水平高于香熏组(P<0.05)，Bax/Bcl-2水平低于香熏组(P<0.05)。

综上所述，合真醒神香穴位贴敷和香熏预处理对大鼠卒中缺血再灌注损伤具有保护作用，可明显减轻神经功能缺损，减小脑梗死体积，减少细胞凋亡，其作用机制可能与降低海马区和皮质部IL-1β、IFN-γ、TNF-α水平，抑制炎性反应，抑制缺血部位Caspase-3和Bax的表达，促进Bcl-2的表达，降低Bax/Bcl-2水平，发挥抗细胞凋亡作用有关，其中穴位贴敷干预的效果较香熏干预作用更为广泛，效果更佳，对合真醒神香的临床应用具有一定的指导作用。